氨基酸的分離鑒定—紙層析法

《氨基酸的分離鑒定—紙層析法》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。

1、化學(xué)與生物工程學(xué)院生物工程系生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告課程名稱：生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：氨基酸的分離鑒定—紙層析法實(shí)驗(yàn)室名：生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2012-11-15任課老師：楊艷專業(yè)班級(jí)：生物工程1142學(xué)生姓名：髙曄學(xué)號(hào)：201121030219組別：第五組實(shí)驗(yàn)內(nèi)容【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹客ㄟ^氨基酸的分離，學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理，掌握氨基酸紙層析的操作方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】紙層析法（paperchromatography）通常用于蛋白質(zhì)的氨基酸成分的定性和定量。1944年A．J．P．馬丁第一次用紙層析分析氨基酸，得到很好的分離效果。到現(xiàn)在為止，紙層析

2、法已經(jīng)成為定性或定量測(cè)定多肽，核酸堿基，糖，有機(jī)酸，維生素，抗生素等物質(zhì)的一種最簡(jiǎn)單易行的分離分析工具。層析用于分析簡(jiǎn)單的混合物時(shí)可做單向?qū)游觥?duì)于復(fù)雜的混合物，可做雙向?qū)游觥Ｆ湓硎且詾V紙為惰性支持物的分配層析，層析溶劑由有機(jī)溶劑和水組成。濾紙纖維上的羥基具有親水性，吸附一層水作為固定相，有機(jī)溶劑為流動(dòng)相。當(dāng)有機(jī)相流經(jīng)固定相時(shí)，由于分配系數(shù)不同，結(jié)果物質(zhì)在兩相間不斷分配而得到分離。其一般操作是將樣品溶解在適當(dāng)溶劑中，點(diǎn)樣在濾紙的一端；再選用適當(dāng)?shù)娜軇┫到y(tǒng)，從點(diǎn)樣的一端通過毛細(xì)現(xiàn)象向另一端展開，展開完畢，取出濾紙晾干或烘干，

3、再以適當(dāng)?shù)娘@色劑或紫外燈、熒光燈下觀察其圖譜。樣品經(jīng)展開后某一物質(zhì)在紙層析譜上的位置常用比移值（rateoffolw,Rf）來表示。Rf=原點(diǎn)至層析斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)至溶劑前沿的距離=X/Y???在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與被測(cè)物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用單向紙層析法分離氨基酸?！緦?shí)驗(yàn)器材】1器材層析缸、毛細(xì)管、小燒杯、量筒、培養(yǎng)皿、分液漏斗、層析濾紙(新華一號(hào))、噴霧器（或白瓷盤），烘箱（或吹風(fēng)機(jī)）、鉛筆、直尺2試劑1)、擴(kuò)展劑???40mL將20mL水

4、飽和的正丁醇和5mL醋酸以體積比4：1在分液漏斗中進(jìn)行混合。然后與15mL蒸餾水混合，充分振蕩，靜置后分層，放出下層水層。取漏斗內(nèi)的擴(kuò)展劑約5mL置于小燒杯中做平衡溶劑，其余的倒人培養(yǎng)皿中備用。2)、氨基酸溶液0．5％的賴氨酸、脯氨酸、亮氨酸溶液及它們的混合液(各組份濃度均為0．5％)各配置5mL。3)、顯色劑???50～100mL0．1％水合茚三酮正丁醇溶液?！緦?shí)驗(yàn)步驟】（1）檢查培養(yǎng)皿是否干燥、潔凈；若否，將其洗凈并置于干燥箱內(nèi)120℃烘干。（2）平衡：剪一大塊塑料薄膜鋪在桌面上，將層析缸或大燒杯到置于塑料薄膜上，再把盛

5、有約5mL展層溶液的小燒杯置于倒置的層析缸或大燒杯中，用塑料薄膜密封起來，平衡20min。（3）規(guī)劃：帶上手套，取寬約10cm、高約15cm的層析濾紙一張。在紙的下端距邊緣2～3cm處輕輕用鉛筆劃一條平行于底邊的直線A，在直線上做4個(gè)記號(hào)，記號(hào)之間間隔2cm，這就是原點(diǎn)的位置。另在距左邊緣1cm處畫一條平行于左邊緣的直線B，在B線上以A、B兩線的交點(diǎn)為原點(diǎn)標(biāo)明刻度（以厘米為單位），參見下圖。圖2實(shí)驗(yàn)裝置示意圖（4）點(diǎn)樣：用毛細(xì)管分別取10mL左右的氨基酸樣品點(diǎn)在四個(gè)位置上。干后重復(fù)點(diǎn)樣，同一位置上需點(diǎn)2～3次，2～3mL/次

6、，保證每點(diǎn)在紙上擴(kuò)散的直徑最大不超過3mm。其中3個(gè)是已知樣，1個(gè)是待測(cè)樣品。（5）層析：用針、線將濾紙縫成筒狀，紙的兩側(cè)邊緣不能接觸且要保持平行，參見圖1-1。向培養(yǎng)皿中加入擴(kuò)展劑，使其液面高度達(dá)到1cm左右，將點(diǎn)好樣的濾紙筒直立于培養(yǎng)皿中（點(diǎn)樣的一端在下，擴(kuò)展劑的液面在A線下約1cm），罩上大燒杯，仍用塑料薄膜密封。當(dāng)擴(kuò)展劑上升到A線時(shí)開始計(jì)時(shí)，每隔一定時(shí)間測(cè)定一下擴(kuò)展劑上升的高度，填入表1中。當(dāng)上升到15～18cm，取出濾紙，剪斷連線，立即用鉛筆描出溶劑前沿線，自然風(fēng)干或用電吹風(fēng)熱風(fēng)吹干。（6）顯色：用噴霧器在通風(fēng)廚中

7、向?yàn)V紙上均勻噴上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分鐘(100℃)或用熱風(fēng)吹干即可顯出各層析斑點(diǎn)。（7）計(jì)算各種氨基酸的Rf值，并判斷混合樣品中都有哪些氨基酸，各人將自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果貼在實(shí)驗(yàn)報(bào)告上，見表2。（8）以層析時(shí)間為橫坐標(biāo)，擴(kuò)展劑上升高度為縱坐標(biāo)畫圖，求出擴(kuò)展劑上升到15cm時(shí)所需要的時(shí)間?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)處理】表1擴(kuò)展劑前沿上升速度X（min）0510152030406090…?Y（cm）00.81.52.153.754.85?5.9?7.98.88...15表2各種氨基酸的Rf值?賴氨酸脯氨酸亮氨酸待測(cè)氨

8、基酸原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離?0.11?0.43?0.70?0.44原點(diǎn)到溶劑前沿的距離?0.88?0.88?0.88?0.88Rf?0.12?0.48?0.79?0.50判斷待測(cè)氨基酸?賴氨酸、脯氨酸、亮氨酸【實(shí)驗(yàn)結(jié)論】通過實(shí)驗(yàn)可以知道每種氨基酸的在擴(kuò)展劑中的移動(dòng)速率是不相同的，利用每種