紙層析法分離鑒定氨基酸

《紙層析法分離鑒定氨基酸》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、實(shí)驗(yàn)二、紙層析法分離鑒定氨基酸一、目的：學(xué)習(xí)并掌握紙層析法分離鑒定氨基酸的原理和方法。二、原理紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法，其中濾紙纖維上吸附的水是固定相，展層用的有機(jī)溶劑是流動(dòng)相。在層析時(shí)，將樣品點(diǎn)在距濾紙一端約2～3cm的某一處，該點(diǎn)稱為原點(diǎn)；然后在密閉容器中層析溶劑沿濾紙的一個(gè)方向進(jìn)行展層，這樣混合氨基酸在兩相中不斷分配。由于分配系數(shù)（Kd）不同，結(jié)果它們分布在濾紙的不同位置上。物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置，可用比移值（Rf）來表示。所謂Rf，是指在紙層析中，從原點(diǎn)至氨基酸停留點(diǎn)（又稱為層析點(diǎn)）中心的距離（X）與原點(diǎn)至溶劑前沿的距離（Y

2、）的比值。如圖在一定條件下（如溫度、展層劑的組成、層析紙質(zhì)量等不變），某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)，因此可作為定性依據(jù)。由于氨基酸無色，可利用茚三酮反應(yīng)使氨基酸層析斑點(diǎn)顯色，從而作定性分析。本實(shí)驗(yàn)利用紙層析法分離氨基酸。三、操作1.在層析缸中裝入展層劑，其高度約1.5～2cm。2.準(zhǔn)備濾紙:戴上手套，取層析濾紙（長22cm、寬14cm）一張，在紙的一端距邊緣3cm處用鉛筆畫一條直線，在此直線上每間隔2cm作一記號(hào)，為點(diǎn)樣位置（即原點(diǎn)），如圖。注意事項(xiàng)：手不能直接接觸濾紙；直線與底邊平行。3.點(diǎn)樣：用毛細(xì)管依次將Lys(賴)、Gly(甘)、Pro(脯)、Val(纈)、

3、Leu(亮)和混合樣品分別點(diǎn)在這6個(gè)位置上，點(diǎn)樣點(diǎn)干后再點(diǎn)一次。注意每點(diǎn)在紙上擴(kuò)散的直徑，最大不超過3mm。紙層析點(diǎn)樣標(biāo)準(zhǔn)圖LysGlyProValLeu混合樣品4、展層：將點(diǎn)好樣的濾紙(點(diǎn)樣面朝外)卷成筒狀，用透明膠紙粘接或用線縫好，紙的兩邊不能接觸。將濾紙直立于層析缸中（注意：點(diǎn)樣的一端在下，展層劑的液面需低于點(diǎn)樣線1cm，濾紙勿與缸壁接觸），蓋好層析缸蓋，進(jìn)行展層。待溶劑上升15～20cm時(shí)，取出濾紙，用鉛筆描出溶劑前沿界線，電吹風(fēng)吹干。5、顯色：用噴霧器均勻噴上0.1％水合茚三酮正丁醇溶液，然后用電吹風(fēng)吹干即可顯出各層析斑點(diǎn)。卷成筒狀的濾紙氨基酸顯色后

4、的圖譜溶劑前沿XY四、計(jì)算：用直尺測量并計(jì)算出各種氨基酸的Rf值。樣品aa標(biāo)準(zhǔn)aaRf混合aaRf賴氨酸甘氨酸脯氨酸纈氨酸亮氨酸試劑和器材：1.試劑：(1)氨基酸溶液：0.5%(m/V)的賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它們的混合液(各組分的濃度均為0.5％)。(2)展層劑：正丁醇∶冰醋酸∶水＝4∶1∶3(V/V)。(3)顯色劑：0.1％(m/V)水合茚三酮正丁醇溶液。2.器材：層析缸；層析濾紙（新華一號(hào)）；毛細(xì)管;噴霧器；電吹風(fēng)；直尺；鉛筆；針線或透明膠帶；一次性手套。