紙層析法分離氨基酸

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1、紙層析法分離氨基酸指導(dǎo)教師：程靖實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）通過(guò)對(duì)氨基酸的分離，學(xué)習(xí)運(yùn)用紙色譜法分離混合物的基本原理，掌握紙色譜的操作方法；2）學(xué)習(xí)如何根據(jù)不同組分的分離結(jié)果來(lái)鑒別未知試樣的組分。實(shí)驗(yàn)原理：紙色譜分離法又稱紙層析法，是根據(jù)不同物質(zhì)在兩相中的分配比不同而進(jìn)行分離的一種微量分離方法。紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析。濾紙纖維上的羥基具有親水性，吸附一層水作為固定相，有機(jī)溶劑為流動(dòng)相。當(dāng)有機(jī)相流經(jīng)固定相時(shí)，物質(zhì)在兩相間不斷分配而得到分離。溶質(zhì)在濾紙上的移動(dòng)速度用Rf值表示：Rf=原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離實(shí)驗(yàn)原理：原點(diǎn)展開后斑

2、點(diǎn)溶劑前沿a1a2bAB實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理儀器試劑實(shí)驗(yàn)步驟注意事項(xiàng)思考題Rf：0~1，Rf值相差越大，分離效果越好。本實(shí)驗(yàn)分離和鑒定的氨基酸混合液：異亮氨酸、賴氨酸和谷氨酸。無(wú)色物質(zhì)的紙色譜可用光譜法（紫外光照射）或顯色法鑒定，氨基酸紙色譜圖譜常用茚三酮或吲哚醌作為顯色劑，本實(shí)驗(yàn)采用茚三酮作為顯色劑。顯色機(jī)理：（1）（2）(3)儀器試劑：主要儀器：（1）玻璃層析筒120mm×250mm(φ×h)。（2）層析紙條100mm×220mm。（3）毛細(xì)管直徑1mm左右。（4）噴霧器。（5）直尺，鉛筆，電吹風(fēng)，一次性手套。主要試劑：（1）展開劑正丁醇:甲酸:水＝60

3、:12:8。（2）氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液2g·L-1水溶液。（3）茚三酮1g·L-1乙醇溶液。（4）氨基酸混合試液將（2）配制的三種氨基酸等量混合。實(shí)驗(yàn)操作：1.在層析缸中裝入展開劑，其高度約1.5~2.0cm；2.準(zhǔn)備濾紙：戴上手套，取層析濾紙一張，在紙的另一端距邊緣3.0cm處用鉛筆畫一直線，在此直線上每隔2cm作一記號(hào)，為點(diǎn)樣位置（即原點(diǎn)）；3.點(diǎn)樣：用毛細(xì)血管依次將異亮氨酸，谷氨酸，賴氨酸和混合樣品分別滴在四個(gè)位置，點(diǎn)樣干后再點(diǎn)一次；注意事項(xiàng)：每個(gè)點(diǎn)在紙上擴(kuò)散的直徑，最大不超過(guò)3mm；實(shí)驗(yàn)步驟——點(diǎn)樣3.0cm3.0cm1234異亮氨酸賴氨酸谷氨酸混合液

4、各點(diǎn)φ≈2mm實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理儀器試劑實(shí)驗(yàn)步驟注意事項(xiàng)思考題4.展層：將濾紙直立于層析缸中（點(diǎn)樣的一端在下，展開劑的液面需低于點(diǎn)樣線1cm，濾紙勿與缸壁接觸），蓋好層析缸蓋，進(jìn)行展層，待溶劑上升15~20cm時(shí)，取出濾紙，用鉛筆描出溶劑前沿界線，電吹風(fēng)吹干；5.顯色：用噴霧器均勻噴上水合茚三酮乙醇溶液，然后用電吹風(fēng)吹干，即可顯出各層析斑點(diǎn)。紙層析結(jié)果賴氨酸異亮氨酸谷氨酸原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離原點(diǎn)到溶劑前沿的距離標(biāo)準(zhǔn)aaRf混合aaRf實(shí)驗(yàn)處理：思考題：1.紙層析法屬于吸附層析還是分配層析，為什么？2.此三種氨基酸還能用什么層析方法進(jìn)行分離，為什么？