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《熒光原位雜交(fish)探針的制備及其應(yīng)用》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、熒光原位雜交（FISH）探針的制備及其應(yīng)用概述1、克隆性染色體異常是腫瘤的特征2、染色體異常常見(jiàn)的類型3、染色體異常的檢測(cè)方法二、熒光原位雜交及其探針1、熒光原位雜交的原理2、熒光原位雜交的探針三、熒光原位雜交探針的制備和熒光原位雜交（按試驗(yàn)流程介紹）一、概述1、克隆性染色體異常是腫瘤的特征1914年德國(guó)遺傳學(xué)家Boveri就提出染色體畸變與腫瘤起源相關(guān)，然而這還僅僅只是一個(gè)假說(shuō)；1960年Nowell和Hungerford在7例慢性髓系白血?。╟hronicmyeloidleukemia，CML）的患者中發(fā)現(xiàn)后來(lái)被稱為費(fèi)城染色體（Philadelphiachromosome）的微小染色體；
2、1973年Rowley證實(shí)了Ph染色體是9號(hào)和22號(hào)染色體易位所致，這是人們?cè)谀[瘤中認(rèn)識(shí)到的第一個(gè)染色體易位；目前，已經(jīng)有11,500篇文獻(xiàn)報(bào)道了55,600多種克隆性細(xì)胞遺傳學(xué)異常。這些染色體畸變，尤其是染色體易位及其相應(yīng)的融合基因在腫瘤致病的起始階段有著重要的作用，無(wú)不說(shuō)明克隆性細(xì)胞遺傳學(xué)異常是腫瘤的特征，在腫瘤起源中起重要作用。下圖是各種疾病報(bào)告的克隆性染色體異常病例數(shù)2、染色體異常的常見(jiàn)類型染色體異常指數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常兩類：前者包括整條染色體數(shù)目的擴(kuò)增和缺失；后者包括染色體易位、插入、倒置、區(qū)帶的缺失或擴(kuò)增等。下圖是染色體數(shù)目異常染色體結(jié)構(gòu)異常3、染色體異常的檢測(cè)方法染色體異常的識(shí)
3、別得益于二十世紀(jì)六十年代后發(fā)展起來(lái)的胰蛋白酶－姬姆薩染色和常規(guī)顯帶技術(shù)，使得常規(guī)篩查全基因組染色體異常和檢測(cè)染色體核型改變成為可能。染色體顯帶是細(xì)胞遺傳學(xué)分析技術(shù)中標(biāo)準(zhǔn)和常用的方法，但耗時(shí)且依賴于獲得良好的分裂相，還難于分析復(fù)雜和隱匿的異常。PCR或熒光原位雜交（FISH，fluorescentinsituhybridization）對(duì)染色體異常的檢出依賴于引物或探針與模板的結(jié)合，因此較常規(guī)顯帶具有更高的特異性，是高通量檢測(cè)染色體異常的敏感和特異的方法。熒光原位雜交及其探針1、熒光原位雜交的原理染色體熒光原位雜交始于傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)和DNA技術(shù)的結(jié)合，這種結(jié)合開(kāi)創(chuàng)了一門新的學(xué)科——分子細(xì)胞遺
4、傳學(xué)。其基礎(chǔ)是Southernblot原理，以半抗原如生物素、地高辛間接標(biāo)記或以熒光素直接標(biāo)記的已知核酸分子為探針，探針和靶序列雙鏈DNA變性后雜交，互補(bǔ)的異源單鏈DNA分子在適宜的溫度和離子強(qiáng)度下退火形成穩(wěn)定的異源雙鏈DNA，通過(guò)熒光標(biāo)記的親和素或抗地高辛抗體將半抗原顯示出來(lái)，通過(guò)熒光顯微鏡觀察雜交信號(hào)。FISH具有快速靈敏、特異性好的特點(diǎn)，可同時(shí)分析分裂期和間期的多個(gè)細(xì)胞，并進(jìn)行定量；可以檢測(cè)隱匿或微小的染色體畸變以及復(fù)雜核型；還可以使用多種熒光標(biāo)記，顯示DNA片段及基因之間的相對(duì)位置與方向，空間定位精確。2、熒光原位雜交探針的類型FISH技術(shù)種類甚多，發(fā)展迅速，其實(shí)現(xiàn)需要獲得能與靶序列
5、互補(bǔ)結(jié)合的探針。常用的探針有以下三類：1、染色體重復(fù)序列探針，主要是指著絲粒α-衛(wèi)星DNA重復(fù)序列探針和端粒重復(fù)序列探針，用以檢測(cè)染色體數(shù)目異常，同時(shí)由于G顯帶時(shí)，端粒區(qū)是蒼白的，因此涉及此區(qū)的易位常難以檢測(cè)，而應(yīng)用端粒探針則彌補(bǔ)了G顯帶的不足；2、染色體涂染探針，包括通過(guò)流式分選或顯微切割獲得的全染色體或染色體臂以及特異性區(qū)帶的涂染探針，用以檢測(cè)染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常；3、染色體單一序列探針，包括各類人工染色體探針，如酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)、細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）、P1人工染色
6、體（P1artificialchromosome,PAC）探針，主要用以識(shí)別染色體的易位、缺失和擴(kuò)增。α-衛(wèi)星DNA（alphasatelliteDNA）是唯一一個(gè)存在于所有人類染色體著絲粒區(qū)域的著絲粒DNA（centromereDNA，CEN-DNA）家族，由171bp的單體為單位組成的高度串聯(lián)重復(fù)片段，重復(fù)數(shù)百次至數(shù)千次，跨越長(zhǎng)達(dá)100kb的著絲粒DNA區(qū)域，其雜交將產(chǎn)生很強(qiáng)的雜交信號(hào)。因此常被選為著絲粒探針的來(lái)源。TheWellcomeTrustSangerInstitute（Hinxton,Cambridge）由WellcomeTrust和BritishMedicalResearch
7、Council聯(lián)合建立，是世界上較早開(kāi)展人類基因組大規(guī)模測(cè)序并具有相當(dāng)實(shí)力的測(cè)序中心。該中心利用能容納大片段人類基因組DNA的高容量載體（如粘粒、BAC、PAC等）構(gòu)建了大片段人類基因組DNA文庫(kù)，通過(guò)文庫(kù)中末端相互重疊的DNA片段連接成疊連群（contig）并與鳥槍法相結(jié)合，加快了基因組測(cè)序，實(shí)現(xiàn)了人類基因組計(jì)劃（HumanGenomeProject，HGP）中人類基因組的物理作圖（physicalmapp
