熒光原位雜交(fish)探針的制備及其應用

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1、熒光原位雜交（FISH）探針的制備及其應用概述1、克隆性染色體異常是腫瘤的特征2、染色體異常常見的類型3、染色體異常的檢測方法二、熒光原位雜交及其探針1、熒光原位雜交的原理2、熒光原位雜交的探針三、熒光原位雜交探針的制備和熒光原位雜交（按試驗流程介紹）一、概述1、克隆性染色體異常是腫瘤的特征1914年德國遺傳學家Boveri就提出染色體畸變與腫瘤起源相關(guān)，然而這還僅僅只是一個假說；1960年Nowell和Hungerford在7例慢性髓系白血病（chronicmyeloidleukemia，CML）的患者中發(fā)現(xiàn)后來被稱為費城染色體（Philadelphiachromosome）的微小染色體；

2、1973年Rowley證實了Ph染色體是9號和22號染色體易位所致，這是人們在腫瘤中認識到的第一個染色體易位；目前，已經(jīng)有11,500篇文獻報道了55,600多種克隆性細胞遺傳學異常。這些染色體畸變，尤其是染色體易位及其相應的融合基因在腫瘤致病的起始階段有著重要的作用，無不說明克隆性細胞遺傳學異常是腫瘤的特征，在腫瘤起源中起重要作用。下圖是各種疾病報告的克隆性染色體異常病例數(shù)2、染色體異常的常見類型染色體異常指數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常兩類：前者包括整條染色體數(shù)目的擴增和缺失；后者包括染色體易位、插入、倒置、區(qū)帶的缺失或擴增等。下圖是染色體數(shù)目異常染色體結(jié)構(gòu)異常3、染色體異常的檢測方法染色體異常的識

3、別得益于二十世紀六十年代后發(fā)展起來的胰蛋白酶－姬姆薩染色和常規(guī)顯帶技術(shù)，使得常規(guī)篩查全基因組染色體異常和檢測染色體核型改變成為可能。染色體顯帶是細胞遺傳學分析技術(shù)中標準和常用的方法，但耗時且依賴于獲得良好的分裂相，還難于分析復雜和隱匿的異常。PCR或熒光原位雜交（FISH，fluorescentinsituhybridization）對染色體異常的檢出依賴于引物或探針與模板的結(jié)合，因此較常規(guī)顯帶具有更高的特異性，是高通量檢測染色體異常的敏感和特異的方法。熒光原位雜交及其探針1、熒光原位雜交的原理染色體熒光原位雜交始于傳統(tǒng)的細胞遺傳學和DNA技術(shù)的結(jié)合，這種結(jié)合開創(chuàng)了一門新的學科——分子細胞遺

4、傳學。其基礎是Southernblot原理，以半抗原如生物素、地高辛間接標記或以熒光素直接標記的已知核酸分子為探針，探針和靶序列雙鏈DNA變性后雜交，互補的異源單鏈DNA分子在適宜的溫度和離子強度下退火形成穩(wěn)定的異源雙鏈DNA，通過熒光標記的親和素或抗地高辛抗體將半抗原顯示出來，通過熒光顯微鏡觀察雜交信號。FISH具有快速靈敏、特異性好的特點，可同時分析分裂期和間期的多個細胞，并進行定量；可以檢測隱匿或微小的染色體畸變以及復雜核型；還可以使用多種熒光標記，顯示DNA片段及基因之間的相對位置與方向，空間定位精確。2、熒光原位雜交探針的類型FISH技術(shù)種類甚多，發(fā)展迅速，其實現(xiàn)需要獲得能與靶序列

5、互補結(jié)合的探針。常用的探針有以下三類：1、染色體重復序列探針，主要是指著絲粒α-衛(wèi)星DNA重復序列探針和端粒重復序列探針，用以檢測染色體數(shù)目異常，同時由于G顯帶時，端粒區(qū)是蒼白的，因此涉及此區(qū)的易位常難以檢測，而應用端粒探針則彌補了G顯帶的不足；2、染色體涂染探針，包括通過流式分選或顯微切割獲得的全染色體或染色體臂以及特異性區(qū)帶的涂染探針，用以檢測染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常；3、染色體單一序列探針，包括各類人工染色體探針，如酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)、細菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）、P1人工染色

6、體（P1artificialchromosome,PAC）探針，主要用以識別染色體的易位、缺失和擴增。α-衛(wèi)星DNA（alphasatelliteDNA）是唯一一個存在于所有人類染色體著絲粒區(qū)域的著絲粒DNA（centromereDNA，CEN-DNA）家族，由171bp的單體為單位組成的高度串聯(lián)重復片段，重復數(shù)百次至數(shù)千次，跨越長達100kb的著絲粒DNA區(qū)域，其雜交將產(chǎn)生很強的雜交信號。因此常被選為著絲粒探針的來源。TheWellcomeTrustSangerInstitute（Hinxton,Cambridge）由WellcomeTrust和BritishMedicalResearch

7、Council聯(lián)合建立，是世界上較早開展人類基因組大規(guī)模測序并具有相當實力的測序中心。該中心利用能容納大片段人類基因組DNA的高容量載體（如粘粒、BAC、PAC等）構(gòu)建了大片段人類基因組DNA文庫，通過文庫中末端相互重疊的DNA片段連接成疊連群（contig）并與鳥槍法相結(jié)合，加快了基因組測序，實現(xiàn)了人類基因組計劃（HumanGenomeProject，HGP）中人類基因組的物理作圖（physicalmapp