海帶多糖的提取和鑒定實(shí)驗(yàn)方案

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1、海帶多糖的提取和鑒定實(shí)驗(yàn)方案化藥：1104姓名：林文生學(xué)號(hào)：110150103一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，掌握酶法提取海帶硫酸多糖的原理和操作流程；2，了解多糖物質(zhì)的常規(guī)純化方法及原理；3，熟悉多糖含量測(cè)定的常用方法和原理；4，掌握硫酸－蒽酮法測(cè)定多糖的原理及操作流程、注意事項(xiàng)；二、實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)綜合利用細(xì)胞勻漿和纖維素酶水解，破碎海帶細(xì)胞壁，釋放細(xì)胞內(nèi)容物，包括多糖、海藻酸以及蛋白、核酸等；隨后通過海藻酸與Ca2+的結(jié)合沉淀形成不溶性海藻酸鈣，以去除其中的海藻酸；繼而通過CTAB與多糖絡(luò)合后溶解度下降的特性，將多糖與其他成份分離；最后在鹽溶液中回溶多糖，并通過乙醇沉淀法獲

2、得多糖沉淀，即為海帶粗多糖?？刹捎昧蛩幔焱y(cè)定多糖的含量三、實(shí)驗(yàn)材料及試劑實(shí)驗(yàn)材料：干海帶實(shí)驗(yàn)試劑：纖維素酶、1mol/L氯化鈣溶液、硫酸、蒽酮、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、葡萄糖、等儀器：組織勻漿機(jī)、水浴鍋、臺(tái)式高速離心機(jī)、分光光度計(jì)四、實(shí)驗(yàn)步驟1．干海帶加水浸泡過夜，充分溶脹后，加入1/3體積的水，放入組織勻漿機(jī)中，粉碎成海帶漿。取約100ml海帶漿，調(diào)PH值為4.5-5.0，加入0.3g纖維素酶，于50度溫浴水解4-6小時(shí)，間或攪拌，促進(jìn)細(xì)胞壁水解。2..在海帶漿中加入50ml水，攪拌均勻，沸水浴5min，使纖維素酶失活，冷至室溫，用6層紗布過濾

3、，收集濾液（注：1、這個(gè)時(shí)候一定不要混入海帶渣，防止對(duì)后面測(cè)量結(jié)果的影響，2、過濾過程中可戴手套擠紗布，但是不要太用力使海帶渣意外流出）3．向?yàn)V液中加入1/4體積1mol/L氯化鈣溶液，攪拌均勻后，4層紗布過濾，去除海藻酸鈣。（這個(gè)時(shí)候過濾比較簡(jiǎn)單，因?yàn)楹Ｔ逅徕}是絮狀沉淀，易過濾）4．于濾液中加入1/5體積的2%CTAB與海帶多糖結(jié)合沉淀，12000rpm離心5min收集CTAB-多糖沉淀物。(1.要經(jīng)過離心的兩個(gè)管一定要配平，平行操作2.兩個(gè)管相對(duì)放置3.離心參數(shù)設(shè)置4.記憶)5．在CTAB-多糖絡(luò)合沉淀物中加入0.5ml2mol/L氯化鉀溶液，通過鹽解作用，

4、溶解釋放海帶多糖，然后加入2倍體積無水乙醇沉淀多糖，12000rpm離心5min。五，硫酸-蒽酮法測(cè)定海帶多糖含量1.配制硫酸-蒽酮試劑:取2g蒽酮溶解于1000ml濃H2SO4中，當(dāng)日配制使用。2.繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線:準(zhǔn)確量取100μg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00ml，注入糖管中，補(bǔ)充純水至1.00ml（下表）。并分別加入4.00ml硫酸-蒽酮試劑，蓋塞后立即搖勻，迅速浸入冷水浴中，各管加完后一起置于沸水浴中10min，，封口防蒸發(fā)，取出流水冷卻，室溫放置10分鐘，于620nm處比色，測(cè)定吸光度值。以測(cè)得的

5、吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。3．海帶多糖含量測(cè)定:將海帶粗多糖以適量水溶解（約為10-80ug/ml），并準(zhǔn)確量取1.00ml待測(cè)溶液，加入4ml硫酸-蒽酮試劑，同標(biāo)準(zhǔn)曲線之操作，比色測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算糖含量。0.2ml—2ml（10倍）0.2ml—2ml（10倍）1ml—2ml（20倍）1ml—2ml（40倍）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)序號(hào)123456710倍20倍40倍葡萄糖含量(μg/ml)01020406080100823015吸光度A0.280六、注意事項(xiàng)：1.海帶細(xì)胞壁以纖維素為主，因此可用纖維素酶水解細(xì)胞壁破碎細(xì)胞，酶解作用溫和，對(duì)于細(xì)

6、胞內(nèi)容物成分影響較小。2.在海帶多糖的提取過程中，海藻酸類物質(zhì)是主要的雜質(zhì)成分，本實(shí)驗(yàn)通過加入Ca2+與海藻酸結(jié)合成為不溶性的海藻酸鈣沉淀，去除海藻酸，初步純化多糖。3.CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）是一種陽離子表面活性劑，在低離子強(qiáng)度的溶液中具有沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，而在高離子強(qiáng)度的溶液里，CTAB又可與蛋白質(zhì)和大多數(shù)酸性多聚糖以外的多糖形成復(fù)合物。因此，本實(shí)驗(yàn)利用了CTAB沉淀多糖的性質(zhì)，將多糖與其他成份分離，且這種酸性多糖沉淀物可在一定鹽濃度下被重新溶解而不引起其他性質(zhì)的改變，可用于多糖的純化4.多糖中常含有大量羥基，極性較大，在水溶液中溶解性很好

7、，而在低極性的有機(jī)溶劑（如乙醇）中溶解度較小，因此，向多糖溶液中加入乙醇，可降低水溶液的介電常數(shù)，使多糖脫水從而產(chǎn)生沉淀來濃縮多糖。