資源描述：
《骨髓細胞染色試驗步驟》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、【實驗原理】染色體是染色質的高度凝集狀態(tài)，化學成分與染色質相同，都由DNA和組蛋白等成分組成。在細胞分裂中期染色體的形態(tài)最清晰，最易于觀察。動物骨髓細胞是制作動物細胞染色體標本的理想材料。骨髓細胞始終保持較強的分裂活性，且細胞數量較多，給動物活體內注射秋水仙素，可以抑制細胞分裂時的紡錘體形成，使處于增殖狀態(tài)的骨髓細胞停止在中期。從而收集到較多的中期分裂相，通過低滲處理，可使細胞膜脹破、染色體分散；固定液處理使染色體結構清晰。為此，骨髓細胞制備染色體標本比利用其它組織可獲得更多的分裂相。同時該方法還具有簡便易行，不需要特殊的設備和無菌操作等優(yōu)點?！緦嶒炗闷贰?．
2、器具：顯微鏡、離心機、恒溫水浴箱、天平、酒精燈、火柴、預冷載玻片、解剖盤、剪刀、鑷子、吸管、10ml刻度離心管、試管架、5ml注射器、染色架、二甲苯、香柏油、擦鏡紙。2．材料：小白鼠。3.試劑：0.01%的秋水仙素、0.075mol/LKCl、Carnoy固定液、10%Giemsa染液。【試劑配制】1．0.01%的秋水仙素：秋水仙素10mg，加滅菌生理鹽水至100ml。（抑制微管聚集，紡錐絲不能形成，使染色體停留于中期時像，具最典型形態(tài)）2．0.075mol/LKCl：稱取KCl5.6g,加蒸餾水至1000ml。3．Carnoy固定液：甲醇與冰醋酸按3：1容積
3、比混合即可。4．10%Giemsa染液：（1）貯存液：Giemsa粉末1g、純甘油66ml、甲醇66ml.稱取Giemsa粉末1g置于研缽中，加少量甘油充分研磨，成無顆粒糊狀。再將全部甘油加入，置于560C溫箱2小時，然后加入甲醇混勻，靜止1天后過濾，保存于棕色瓶中，2周后即可使用。（2）1/15mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)：A液（1/15mol/LKH2PO4）：稱取KH2PO4?9.08g，加蒸餾水至1000ml，混勻溶解即可。B液（1/15mol/LNa2HPO4﹒2H2O）：稱取Na2HPO4﹒2H2O11.88g，加蒸餾水至1000ml，混勻
4、溶解即可。C液（1/15mol/L磷酸鹽緩沖液pH6.8）：取A液50.8ml，B液49.2ml混勻后即可?，F配現用。（3）工作液：臨用時將貯存液與C液按1：9稀釋即可?！緝热菖c方法】1）動物預處理：取材前3～4小時，按4～6μg/g體重的劑量向小白鼠腹腔注射0.01%的秋水仙素。（注意不要傷及內臟）2）取材、收集細胞：用頸椎脫臼方法處死小白鼠，立即用剪刀、鑷子剝離小鼠后肢大腿的皮膚和肌肉，暴露股骨及其兩端的關節(jié)，從兩端關節(jié)處剪下股骨，剔除骨上殘余的肌肉。剪下股骨兩頭端部，暴露骨髓腔，用鑷子夾住股骨中部，使股骨垂直且下端對準離心管口，用5ml注射器（6號針頭）
5、吸取0.075mol/LKCl溶液1ml，從股骨上端將針頭插入骨髓腔，沖洗腔內的骨髓細胞，反復沖洗數次，直至骨髓腔發(fā)白為止，此時離心管中的細胞懸液可達4～5ml。3）低滲：離心（1000/5min）后棄上清，加0.075mol/LKCl溶液至5ml，用吸管將離心管中的細胞懸液充分打勻，置于37C恒溫水浴箱中，低滲處理25～30分鐘。(使細胞中的染色體充分分開，便于計數和觀察)4）預固定：離心，棄上清，在低滲后的收集液中加入新配置的Carnoy固定液至5ml并立即混勻，37度10min平衡后以1000r/分離心8分鐘。棄掉上清液，留取沉淀約0.5ml。5）固定：
6、用吸管沿管壁緩慢加入Carnoy固定液5ml，輕輕將沉淀沖散打勻，室溫靜止20分鐘后，以1000r/分離心8分鐘。棄掉上清液，留取沉淀約0.2ml左右（視沉淀多少而定）。再加Carnoy加固定液2～3滴，用吸管輕輕吹打混勻制成細胞懸液。6）滴片：用吸管吸取細胞懸液少許，滴在清潔預冷過的載玻片上，滴片距離為10～15cm(指滴管口與玻片的距離)。每片滴2～3滴，然后立即用嘴對準所滴的液體輕輕吹氣，使液體在玻片上散開，隨即將載玻片在酒精燈火焰上掠過1～2次（標本面朝上，且不要離火焰太近），稍干即可。用記號筆在標本面標號。置空氣中自然干燥。7）染色：將標本置于染色架
7、上，標本面朝上，用吸管吸取10%Giemsa染液1～2ml滴到玻片標本上，染色10分鐘后，用流水沖去染液，晾干。8）觀察：將制備好的標本先置于低倍鏡下觀察,尋找染色體分散的中期分裂相，移至視野中央，然后換高倍鏡選擇染色體形態(tài)好、分散均勻、不重疊的中期分裂相觀察：①染色體數目的觀察：進行計數前，應先按照該細胞的染色體自然分布狀態(tài)，大致劃分為2～3個區(qū)域，然后按順序數出各區(qū)域的染色體的實際數目，最后累加在一起，即為該細胞的染色體總數。小鼠二倍體細胞染色體數目為：2n=40；②染色體形態(tài)特征觀察：小鼠染色體形態(tài)全部為近端著絲粒染色體，呈“U”形，染色體核型按照染色體
8、從大到小分為四組。性染色體雌性為XX，
