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1、分離小鼠心肌細(xì)胞Protocol實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠,體重20~30g1急性分離心肌細(xì)胞A實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：1）無(wú)鈣臺(tái)氏液：配500mL無(wú)鈣臺(tái)氏液(50mL臺(tái)氏母液+450mL去離子水+1g葡萄糖),用NAOH調(diào)PH，一般在7.35~7.4之間即可，注：充氧后調(diào)PH值，否則充氧后PH下調(diào)。調(diào)PH值前嚴(yán)格校正PH計(jì)，小鼠心肌細(xì)胞對(duì)PH值特別敏感。表1：臺(tái)式母液配方mMMWg/Lg/500ml(10x)NaCl12658.447.36336.82KCl5.474.550.4032.02Hepes10238.32.38311.
2、92MgCl2.6H2O1.0203.30.2031.02NaH2PO4.2H200.33156.010.0520.2574CaCl21.8147.03Glucose10198.2注：CaCl2,Glucose配制時(shí)后加，（濃度0.9MCaCl2母液6.616g(有水)或者4.995g(無(wú)水)+50ml去離子水），0.2mlCaCl2母液/100ml無(wú)鈣臺(tái)氏液2）稱取5mg膠原酶Ⅱ+8mg白蛋白3）配有鈣液200ml：即200ml無(wú)鈣液+0.4mlCaCl2(0.9M)。注：小鼠心肌細(xì)胞對(duì)鈣濃度特別敏感，我
3、們?yōu)榱丝s短心臟復(fù)跳時(shí)間，減少心肌耗氧，把有鈣液中鈣離子濃度降到正常的濃度的1/44)準(zhǔn)備器械：大彎剪刀一把，小直剪刀兩把，直鑷子兩把，止血鉗兩把，彎鑷子兩把，紗布一塊，注射器60mL一個(gè)，10mL一個(gè)；手術(shù)線一團(tuán)(小鼠主動(dòng)脈比較細(xì)，手術(shù)線比大鼠的要細(xì))；表面皿三個(gè)，小燒杯50mL三個(gè)，量筒50mL兩個(gè)，500mL一個(gè)；大燒杯500mL一個(gè)250mL一個(gè)；濾紙若干！滴管4個(gè),7號(hào)注射針頭一個(gè)（尖端磨平，靠近尖端兩厘米處用止血鉗夾出一道深溝以便于固定主動(dòng)脈時(shí)系線）。5）KB液配方mMMWg/LGlutamica
4、cid(谷氨酸)70147.1310.3Taurine(牛黃酸)15125.141.875KCl3074.552.237Hepes10238.32.383MgCl2.6H2O0.5203.30.1015Glucuse10198.21.982EGTA0.5380.40.19KH2PO410136.091.36注：5MKOH調(diào)PH值（7.3-7.4），5MKOH配制：28gKOH溶于100ML去離子水，KB液保存在-20℃冰箱中保存。B實(shí)驗(yàn)過(guò)程1）、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：（1）、準(zhǔn)備儀器：電熱恒溫器（帶水泵的）、Lang
5、endorff灌流系統(tǒng)。（2）、檢查氧氣瓶里是否有氧氣。（3）、打開(kāi)恒溫灌流裝置的電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電熱恒溫器的水溫，泵出的水打入冷凝管，使通過(guò)冷凝管的灌流液保持37℃的恒溫。（4）、清潔Langendorff管路，第一次使用先泡酸后用蒸餾水沖洗干凈，以后每次使用前先用去離子水將Langendorff管沖洗3遍即可開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。（5）、配制好無(wú)鈣的細(xì)胞外液及有鈣液，并取約50ml有鈣液置于表面皿中后放置在冰袋上，使其溫度降到0℃左右；另一50ml有鈣液置于表面皿中放入4℃冰箱待用（6）、向沖洗后的Langendor
6、ff管中加入有鈣液，用注射器輕輕吸出氣泡，并向管中通入氧氣。有鈣液濃度降到正常濃度的1/4，灌入大概50ml有鈣液，上面倒無(wú)鈣液。（7）、分別稱取5mg膠原酶和8mg白蛋白，用約50ml無(wú)鈣液溶解、備用。（8）、10ml注射器連接預(yù)備好的7號(hào)針頭，手術(shù)線打松結(jié)待用。2）、正式試驗(yàn)：（1）、選取小鼠，稱重，用1%戊巴比妥麻醉(腹腔注射），麻醉劑劑量盡量小，如果無(wú)需監(jiān)測(cè)心電可采用斷髓法處死小鼠。不必打肝素，肝素抗凝同時(shí)對(duì)心臟也用副作用。（2）、待麻醉充分后，迅速開(kāi)胸取出心臟（取心臟時(shí)切忌用手碰到心臟，首先用小直
7、剪刀靠近頭段剪斷主動(dòng)脈，用另一只手持直鑷子提起肺組織，從下方游離心臟），放到0℃的有鈣液中洗滌（可以輕輕的用食指按壓心臟，使心臟內(nèi)的血液蹦出來(lái)，同時(shí)觀察蹦出來(lái)的動(dòng)脈孔，即主動(dòng)脈），分離出主動(dòng)脈（主動(dòng)脈不能分離太長(zhǎng)，同時(shí)去除心包膜，即周圍的組織，動(dòng)作要迅速，主動(dòng)脈一般位于兩個(gè)白色胸腺下方，主動(dòng)脈上端可見(jiàn)其三個(gè)分支，沿分支處剪斷主動(dòng)脈，暴露主動(dòng)脈干出口），用預(yù)備好的連在10ml注射器的7號(hào)針頭輕輕插入主動(dòng)脈，用手術(shù)線固定主動(dòng)脈（使灌流針頭在主動(dòng)脈的根部即可，太向下或者太向上灌流效果都不好，一般在肺動(dòng)脈圓錐上端）
8、，將Langendorff管上三通打開(kāi)，液體流出，然后把固定心臟的7號(hào)針頭連接到Langendorff管上，用有鈣液灌流，同時(shí)觀察肺動(dòng)脈流出道是否被堵住，如果堵住立即用小剪刀剪開(kāi)（同時(shí)觀察液體流下的速度，調(diào)節(jié)灌流針的深度）待心臟跳動(dòng)幾次后，加入無(wú)鈣液，直至心臟停止跳動(dòng)（完全停止，否則影響酶的消化，同時(shí)用拇指和食指輕輕擠壓心臟感覺(jué)硬度），無(wú)鈣液灌流時(shí)間稍微長(zhǎng)一點(diǎn)比較好，停跳后10~20分鐘加入預(yù)先配好的膠原酶和白蛋
