實(shí)體組織單細(xì)胞懸液制備方法

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1、實(shí)體組織單細(xì)胞懸液制備方法實(shí)體組織單細(xì)胞懸液制備方法實(shí)體組織單細(xì)胞懸液制備方法實(shí)體組織單細(xì)胞懸液制備方法實(shí)體組織單細(xì)胞懸液制備方法?490?臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志JClinExpPathol2007Aug;23(4)實(shí)體組織單細(xì)胞懸液制備方法任興昌,方黎,陳洪勛關(guān)鍵詞:實(shí)體組織;單細(xì)胞懸液;HE染色中圖分類號:R446.8;R944.17文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B文章編號:1001—7399(2007)04—0490—02在實(shí)際工作中由于機(jī)器操作和手工操作均不能保證每張玻片的條件一致,因此到目前為止還沒有有效可靠的對照方法,故其標(biāo)準(zhǔn)化問題日益受到大家的重視.我們以新鮮

2、組織和固定組織為標(biāo)本,探討實(shí)體組織單細(xì)胞懸液制作的具體過程,為實(shí)現(xiàn)一一對照式原位玻片檢測技術(shù)尋求一套全面,可靠的技術(shù)方法.1材料與方法1.1標(biāo)本選擇杭州市中醫(yī)院l臨床活檢標(biāo)本,包括新鮮組織和固定組織,運(yùn)用機(jī)械法,機(jī)械一酶消化法,機(jī)械一化學(xué)法來制備單細(xì)胞懸液.并將制備的單細(xì)胞懸液取少許進(jìn)行HE染色,常規(guī)顯微鏡觀察,以選擇最優(yōu)方法.1.2方法1.2.1機(jī)械打散法將新鮮組織塊用生理鹽水(加入10%的肝素)洗滌,然后浸泡40min;固定組織則在清水中浸泡幾天后用勻漿機(jī)打散或手工磨碎.打散后的產(chǎn)物倒人50ml離心管中,2000r/min離心10min棄上清,加人適

3、量的紅細(xì)胞裂解液,震蕩后靜置40min,2000r/min離心10min后棄上清.加入適量的生理鹽水或PBS液沖洗后,離心棄上清,重復(fù)此步驟2~3次,沉積物加入3倍的特制保存液,4℃保存,取少許涂片進(jìn)行HE染色,封片后鏡檢.1.2.2機(jī)械一酶消化法將組織塊用生理鹽水(加入10%的肝素)洗滌,然后浸泡40rain左右;固定組織用清水浸泡幾天后用刀切成1.O0mm的小塊或用刀在組織塊表面刮出薄薄的細(xì)胞團(tuán)塊.加入10%福爾馬林震蕩后靜置40min,2000r/min離心10min,去上清液,然后加人生理鹽水漂洗.小塊組織加適量的膠原酶Ⅱ溶液在37℃的溫箱中靜置

4、過夜,期間震蕩數(shù)次.280目篩網(wǎng)過濾,取濾液,2000r/min離心10min棄上清;薄細(xì)胞團(tuán)塊則280目篩網(wǎng)過濾后,直接加入適量的紅細(xì)胞裂解液,震蕩后離心棄上清,然后加適量膠原酶Ⅱ溶液在37℃的溫箱中靜置過夜,期間震蕩數(shù)次.2000r/min離心10min棄上清,加入適量的生理鹽水或PBS液沖洗,重復(fù)2~3次,最后于沉淀中加入特制保存液,取少許涂片進(jìn)行HE染色,封片后鏡檢.收稿日期:2006—11—09修回日期:2007一Ol一05作者單位:杭州市中醫(yī)院病理科,杭州310007作者簡介:任興昌,男,主任醫(yī)師.E-mail:xch_ren2000@yah

5、oo.corn1.2.3機(jī)械一化學(xué)法固定組織用清水浸泡幾天后用刀切成1.00mm的小塊或用刀在組織塊表面刮出薄薄的細(xì)胞團(tuán)塊.切成小塊的組織加適量的EDTA溶液靜置過夜,期間震蕩數(shù)次.280目篩網(wǎng)過濾,取濾液,2000r/min離心10min后棄上清;薄細(xì)胞團(tuán)塊則280目篩網(wǎng)過濾后,直接加入適量的紅細(xì)胞裂解液,細(xì)胞團(tuán)塊則280目篩網(wǎng)過濾,取濾液加入適量的紅細(xì)胞裂解液,震蕩后靜置40min,轉(zhuǎn)入50ml離心管中2000r/min離心10min后棄上清.然后加適量的ED.TA溶液靜置過夜,每半小時(shí)震蕩1次.后續(xù)操作同機(jī)械打散法.2結(jié)果在HE染色切片中細(xì)胞核呈藍(lán)

6、色,血紅細(xì)胞呈紅色,細(xì)胞碎片呈淡藍(lán)色,微生物呈藍(lán)色0.通過比較3種制備實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的方法(表1),HE染色后鏡檢結(jié)果表明在細(xì)胞密集度方面,機(jī)械一酶消化法效果最好,機(jī)械法其次,機(jī)械一化學(xué)法較差;細(xì)胞形態(tài)保存方面,3種方法的效果相似;細(xì)胞損壞度方面,機(jī)械法造成大量的細(xì)胞損傷,其它方法的結(jié)果差不多;污染度方面,只有用酶消化一機(jī)械法制備新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液時(shí)出現(xiàn)了少量的桿菌污染;血紅細(xì)胞數(shù)量方面,每種方法均有血紅細(xì)胞存在,但機(jī)械法的較多;細(xì)胞團(tuán)塊方面,只有用機(jī)械一酶消化法制備固定實(shí)體組織單細(xì)胞懸液時(shí)存在一部分細(xì)胞團(tuán)塊.3討論我們用新鮮組織和固定組織為標(biāo)本

7、,進(jìn)行實(shí)體組織單細(xì)胞懸液制作,為組織化學(xué),免疫組織化學(xué),原位雜交等實(shí)現(xiàn)一一對照式的原位玻片檢測技術(shù)尋求一套全面,可靠的技術(shù)方案奠定了實(shí)踐基礎(chǔ).目前雖然新出現(xiàn)了一種Medimachine系統(tǒng),該系統(tǒng)是將實(shí)體組織制備成單細(xì)胞或單細(xì)胞核懸液的自動(dòng)化系統(tǒng)J,但它仍不適用于l臨床病理工作.機(jī)械分散法主要包括剪碎法,網(wǎng)搓法,研磨組織法使細(xì)胞從緊密聯(lián)結(jié)的組織中釋放出來.該方法操作簡便快捷無污染,但常常造成大量的細(xì)胞損傷,細(xì)胞產(chǎn)量較低.為使細(xì)胞碎片不影響檢測結(jié)果,還需采用適當(dāng)?shù)姆椒ǔニ槠?而且固定后直接絞磨所制的單細(xì)胞細(xì)胞膜破壞大,所以機(jī)械法制得對照物的陽性部分最好的

8、是細(xì)胞核和胞質(zhì)’.新鮮組織的細(xì)胞形態(tài)比固定過的組織易受損壞,且前期的處理方法不同

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