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《ish protocol 熒光原位雜交技術 實驗方案》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、地高辛標記寡核苷酸，熒光標記二抗，ISH，冰凍切片操作過程：1、多甲固定：應盡量在半個小時內完成。（固定時間以24-36小時為宜，避免RNA降解或固定過度。）2、切片:為獲得高雜交信號，冰凍切片應切成10um-20um。（選用16um）（切好的片子可以保存在-70度中）但是要注意，保存在-70度中的切片，拿出來以后，立即在4%的多甲中重新固定，避免在重新固定前切片恢復室溫。（重新固定10-15min）3、用0.1MPB洗切片3*5min4、切片放入100%乙醇5min，空氣中干燥。雜交液：（20
2、ml）藏于-20度20*SSC4ml硫酸葡聚糖4g去離子甲酰胺10ml將他們溶解后，加入以下物質：PolyA（10mg/ml）0.5mlSsDNA（10mg/ml）0.5mltRNA（10mg/ml）0.5mlDTT(1M)2ml50*Denhardts0.2ml上述溶液可以配置后長期貯藏與-20度中，用前預熱到37度。雜交溶液：將地高辛加入雜交液中，探針的濃度需要摸索（一般是100ng-1000ng/ml，一般是以200ng/ml為起點來摸索條件），所加的雜交液的體積看切片的大小來決定，對于2
3、cm*2cm的組織，一般是加50ul，但是對于嗅球，可能30-40ul足夠。加好雜交液以后，用蓋玻片蓋上切片（注意中間不要留有任何的氣泡），為防止雜交液從蓋玻片中流走，注意使切片保持水平，并且注意切片不能干燥，（干燥的話雜交會有一個很高的背景）在濕盒中37度雜交18小時，這個雜交時間可以延長到40小時來提高雜交的信號，但是前提是不能讓切片干燥。雜交后處理;制備0.5*SSC和1*SSC（從20*來稀釋）并且保證這兩種SSC在使用的時候的溫度是55度。注意配置0.5*SSC和1*SSC中含有10m
4、M的DTT（將1.2g的DTT加入到800ml的SSC中）雜交后，用小鑷子將蓋玻片輕輕移走，然后倒掉雜交液，將切片放入洗液中，在振搖水浴中按照下面的要求來洗片：快洗：1*SSC（10mMDTT）室溫2*15min：1*SSC（10mMDTT）55度2*15min0.5*SSC(10mMDTT)55度1*10min0.5*SSC（10mMDTT）室溫將切片一直放在最后一步的溶液中一直到下一步操作。檢測：將切片轉移到TBS緩沖液中（100mMtris-HCl，150mMNaCl，PH=7.5），將切
5、片在TBS緩沖液中洗3*5min，封閉：（可選）將切片放在封閉液中放置30min（封閉液配方:TBS+0.1%tritonX-100+1%正常綿羊血清（sigma）或者是1%的其它合適的封閉劑（Roche））,將切片拿出封閉液中，用地高辛抗體和切片在TBS+0.1%tritonX-100+1%正常綿羊血清（sigma）或者是1%的其它合適的封閉劑（Roche）于室溫下孵育至少4小時，然后在TBS中洗3*5min，然后在去離子水洗滌幾次以去除鹽，最后用抗淬滅劑分片觀察原位雜交要做的對照;1、切片中
6、mRNA的質量（前提是新鮮的組織樣品）和protocol的有效性。①PolyT探針：如果PolyT探針雜交的信號很弱的話，說明切片的RNA已經(jīng)降解比較嚴重。2、雜交特異性對照：①檢測探針只是和RNA結合，用RNA酶處理后如果沒有雜交信號的，則說明雜交只是和RNA結合。（注意，RNA酶的處理應該在固定以后用PBS洗兩次*5min立即進行）②用正義和反義探針來雜交，如果用正義探針雜交得不到任何的信號，則可以說明雜交的信號是特異性的雜交預處理：1、在37℃恒溫箱內干燥切片后，滴加5-10μg/ml蛋白
7、酶K，置37℃濕盒內孵育30min，4℃75％酒精漂洗5min中止蛋白酶K活性。一般應用蛋白酶K1μg/ml(于0.1mol/LTris,50mmol/LEDTA,pH8.0緩沖液中)，37℃孵育15~20min，以達到充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態(tài)為目的。蛋白酶K還具有消化包圍著靶DNA的蛋白質的作用，從而提高雜交信號。甘氨酸是蛋白酶K的抑制劑，常用0.1mol/L的甘氨酸溶液(在PBS中)清洗以終止蛋白酶K的消化作用，應用胃蛋白酶(Pepsin)20~100μg/ml(用0.1NHC
8、l配)37℃、30min進行消化，所獲實驗結果優(yōu)于蛋白酶K。為保持組織結構，通常用4%多聚甲醛再固定。2、0.25%醋酸酐10min,經(jīng)70℃2×SSC漂洗、40℃2×SSC各漂洗15min，2×SSC3min，切片經(jīng)75-100%酒精梯度脫水。1.蛋白酶K能消化和暴露被遮蔽的靶核酸，以增加探針的可結合性。蛋白酶K濃度過低，不能使靶核酸有效暴露，濃度過高則組織消化過度，也會影響檢測結果。蛋白酶K須用蛋白酶K緩沖液配制(0.1mol/LTris-HClPH8.0，50mmol/LEDTA，經(jīng)高壓滅
