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《植物生理生化測(cè)定》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、2.1.8轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下的超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定將轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓昀^代于含有0.5%NaCl的MS固體培養(yǎng)上進(jìn)行脅迫培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為27±1℃，每天13h、3000lux光照。脅迫培養(yǎng)4w后，取其葉片測(cè)定其SOD活性，每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)，求其平均數(shù)，并進(jìn)行多重比較。2.1.8.1主要試劑及配方（1）0.1mol/lpH7.8磷酸鈉（Na2HPO4-NaH2PO4）緩沖液A液（0.1mol/lNa2HPO4溶液）：稱取Na2HPO4·12H2O7.163g，用少量蒸餾水溶
2、解后定容至200ml，4℃冰箱中保存?zhèn)溆?；B液（0.1mol/lNaH2PO4溶液）：稱取NaH2PO4·2H2O0.780g，用少量蒸餾水溶解后定容至50ml，4℃冰箱中保存?zhèn)溆?；取上述A液183ml與B液17ml充分混勻后即為0.1mol/lpH7.8的磷酸鈉緩沖液，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＃?）0.026mol/l甲硫氨酸（Met）磷酸鈉緩沖液稱取甲硫氨酸（C5H11NO2S）0.388g，用少量0.1mol/lpH7.8的磷酸鈉緩沖液溶解后，再用相同磷酸鈉緩沖液定容至100ml，現(xiàn)用現(xiàn)配，4℃
3、冰箱中保存可用1～2d。（3）7.5×10-4mol/lNBT溶液稱取NBT（C40H30Cl2N10O6）0.153g，用少量蒸餾水溶解后，定容至250ml，現(xiàn)用現(xiàn)配，4℃冰箱中保存可用2～3d。（4）含1.0μmol/lEDTA的20μmol/l核黃素溶液A液：稱取EDTA0.003g，用少量蒸餾水溶解；B液：稱取核黃素0.075g，用少量蒸餾水溶解；C液：合并A液和B液，定容至100ml，此溶液即為含0.1mmol/lEDTA的2mmol/l核黃素溶液，避光保存（可用黑紙將裝有該液的棕色瓶包
4、好），4℃冰箱中可保存8～10d，當(dāng)測(cè)定SOD酶活時(shí)，將C液稀釋100倍，即為含1.0μmol/lEDTA的20μmol/l核黃素溶液。（5）含2%PVP的0.05mol/lpH7.8磷酸鈉緩沖液取0.1mol/lpH7.8的磷酸鈉緩沖液50ml，加入2gPVP（聚乙烯吡咯烷酮），充分溶解后移入100ml容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.1.8.2提取及測(cè)定方法（1）稱取1.0g樣品葉片于預(yù)冷的研缽中，加入4ml預(yù)冷的提取介質(zhì)（含2%PVP的0.05mol/lpH7.8
5、磷酸鈉緩沖液），冰浴研磨勻漿，轉(zhuǎn)入10ml離心管，并用提取介質(zhì)定容至5ml；（2）4℃10000rpm離心10min，取上清即為酶液提取樣品；（3）取透明度好的10ml離心管，每個(gè)株系3次重復(fù)，按照下表加入試劑：試劑用量（ml）0.05mol/l磷酸緩沖液（2%PVP）0.8750.026mol/lMet緩沖液1.5750μmol/lNBT0.31μmol/lEDTA及20μmol/l核黃素0.3酶提取液（對(duì)照管以磷酸緩沖液代替）0.025總體積3.0（4）設(shè)3個(gè)對(duì)照（CK1、CK2、CK3），將
6、CK1包上鋁箔避光，與其它樣品管（包括CK2和CK3）同時(shí)置于4500lux日光燈下反應(yīng)25min，反應(yīng)溫度28℃；（5）SOD活性測(cè)定與計(jì)算：至反應(yīng)結(jié)束，立即用黑布遮蔽以終止反應(yīng)。以遮光的對(duì)照管CK1作為空白調(diào)零，在560nm波長(zhǎng)下測(cè)定各管的吸光度，CK2和CK3的平均值作為對(duì)照，按下例公式計(jì)算SOD活性（SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位）：SOD活性（U/g）=（OD0-OD560）×VT／（OD0×0.5×FW×V1）OD0——光照對(duì)照管的光吸收值；OD560——樣
7、品管的光吸收值；VT——樣液總體積（ml）；V1——測(cè)定時(shí)樣品用量（ml）；FW——樣品鮮重（g）。2.1.9轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下的丙二醛(MDA)含量測(cè)定將轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照植株繼代于含有0.5%NaCl的MS固體培養(yǎng)上進(jìn)行脅迫培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為27±1℃，每天13h、3000lux光照。脅迫培養(yǎng)4w后，取整株測(cè)定其丙二醛含量，每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)，求其平均數(shù)，并進(jìn)行多重比較。2.1.9.1主要試劑及配方（1）5%三氯乙酸（TCA）：稱取5g三氯乙酸，先用少量蒸餾水溶解，再定容至100ml；（2）0.
8、5%硫代巴比妥酸（TBA）：稱取0.5g硫代巴比妥酸，用5%TCA定容至100ml。2.1.9.2提取及測(cè)定方法（1）稱取1.0g材料，加入10ml5%三氯乙酸（TCA）和少量石英砂，研磨至勻漿；（2）3000rpm離心10min，取上清即為丙二醛提取液；（3）取1.5ml上述提取液（對(duì)照管取1.5ml5%TCA），加入2.5ml0.5%TBA，混勻后于沸水浴中反應(yīng)15min，迅速冷卻；（4）1800g離心10min；（5）取上清液測(cè)定532和600nm波長(zhǎng)處的吸光度，以蒸餾水調(diào)零
