（新編）實(shí)驗(yàn)二 藥物血漿蛋白結(jié)合率測定

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1、實(shí)驗(yàn)二藥物血漿蛋白結(jié)合率測定前言：藥物血漿蛋白結(jié)合率是藥物與血漿蛋白結(jié)合的量占藥物總濃度的百分率，是藥物代謝動(dòng)力學(xué)的重要參數(shù)之一。它影響藥物在體內(nèi)的分布、代謝與排泄，從而影響其作用強(qiáng)度和時(shí)間，并往往與藥物的相互作用及作用機(jī)制等密切相關(guān)。研究藥物血漿蛋白結(jié)合率的方法包括常規(guī)的平衡透析法、超濾法、超速離心法、凝膠過濾法、分配平衡法、穩(wěn)定同位素-GC-MS法、光譜技術(shù)等。本實(shí)驗(yàn)主要通過采用平衡透析法對藥物血漿蛋白結(jié)合率進(jìn)行測定，對于新藥研究開發(fā)和指導(dǎo)臨床合理用藥都具有重要意義。關(guān)鍵詞：血漿蛋白結(jié)合率平衡透析法磺胺嘧啶【實(shí)驗(yàn)原理】平衡透析法的基本原理是將蛋白置于一個(gè)隔室內(nèi)，用半透膜

2、將此隔室與另一隔室隔開。蛋白等大分子不能通過此半透膜，但系統(tǒng)中游離配基可自由通過。當(dāng)達(dá)到平衡時(shí)半透膜兩側(cè)自由配基的濃度相等。若系統(tǒng)中自由配基的總量已知，測定不含蛋白隔室中自由配基的濃度，即可推算與蛋白結(jié)合的配基量。再用重氮化偶合比色測定法對磺胺藥的含量進(jìn)行測定。其測定原理是具有游離氨基的磺胺藥在酸性介質(zhì)中重氮化后，可與N-(1萘基）乙二胺產(chǎn)生偶合反應(yīng)生成紫紅色偶氮染料，再與同樣處理的磺胺藥標(biāo)準(zhǔn)液比較，即可求得剩余的亞硝酸影響測定，用氨基磺酸胺分解除去?！静牧吓c試劑】1.藥物10%磺胺嘧啶鈉注射液2.試劑15%三氯醋酸溶液0.1%亞硝酸鈉溶液0.5%氨基磺酸胺溶液0.1%二鹽

3、酸N-（1萘基）-乙二胺溶液磺胺嘧啶鈉貯存標(biāo)準(zhǔn)液磺胺嘧啶鈉應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液(3.75ug/ml)3.透析液pH7.4的0.02M磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含0.15MNaCl4.雞、兔各3只5.管狀半透膜周長5cm，長約12cm【試劑的配制】1.0.1%二鹽酸N-（1萘基）-乙二胺溶液0.5g溶于95%乙醇約400mL中，再用乙醇稀釋至500ml，棕色瓶于冰箱中保存2.貯存標(biāo)準(zhǔn)液取標(biāo)準(zhǔn)品0.125g溶于蒸餾水中，并稀釋至1000mL。如不溶于水，可先溶于0.1mol/L氫氧化鈉25mL中，再加4mol/L硫酸175mL，用蒸餾水稀釋至1000mL。3.應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液精確吸取貯存標(biāo)準(zhǔn)液3mL，置

4、100mL容量瓶中，用3%三氯醋酸稀釋至刻度。(本實(shí)驗(yàn)是用10%磺胺嘧啶鈉注射液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)液的配制：即吸取3.75ul的10%磺胺嘧啶鈉注射液置于100mL容量瓶中，用3%三氯醋酸稀釋至刻度。)【操作步驟】1.血漿的制備：兔心臟采血，雞翼靜脈采血，肝素抗凝，以3000rpm離心10min，上清液即為血漿。2.將管狀半透膜一端折疊，用紗線扎緊，保留結(jié)扎線段10cm左右，以調(diào)節(jié)袋內(nèi)外液面在同一水平，加血漿樣品2.0ml于上述半透膜袋內(nèi)，并扎緊口袋另一端。注意：袋口不得污染血漿。3.將兩端扎緊的半透膜置于盛有9.75ml透析液的30ml廣口瓶中，用袋兩端線段調(diào)節(jié)袋內(nèi)外液面4.加2.

5、0ml透析液代替血漿于半透膜袋內(nèi)，作平衡時(shí)間對照樣品，以確定藥物從袋內(nèi)外自由擴(kuò)散達(dá)到平衡所需時(shí)間。5.加所試磺胺藥溶液0.25ml于各瓶袋外透析液中。注意：容積越小越好，以免影響透析液的組成6.置廣口瓶于冰箱中，平衡透析時(shí)間約需60h左右。7.待透析平衡后，吸出袋外透析液少許，加等量磺基水楊酸試劑，檢查有無血漿蛋白漏出。如檢查為陽性，則該樣品作廢。8.取出半透膜，用濾紙吸干袋外壁透析液，小心解開透析袋，使袋內(nèi)血漿流入干凈試管。9.用重氮化-偶合比色法測定袋內(nèi)外溶液中磺胺藥濃度1）取袋內(nèi)外溶液各0.5ml，加水15.5ml；加15%三氯醋酸4ml，混勻，靜置2min，過濾。取

6、試管3支，各加入濾液5mL，為測定管。取試管3支，加入空白對照液5mL，為空白管。取試管3支，加入應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液5mL，為標(biāo)準(zhǔn)管。2）在以上各管中各加入0.1%亞硝酸鈉溶液0.5mL，混勻，放置3min。3）各加入0.5%氨基磺酸胺溶液0.5mL，混勻，放置2min。4）各加入0.1%二鹽酸N-（1萘基）-乙二胺溶液2.5mL，充分混勻，放置10min。5）用721分光光度計(jì)在550nm波長處比色以空白管校正光密度到0點(diǎn)，讀取標(biāo)準(zhǔn)管和測定管光密度，計(jì)算游離磺胺藥物含量10.計(jì)算血漿蛋白結(jié)合率計(jì)算公式測定管光密度游離磺胺藥含量（mg%）=×應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液濃度×樣品稀釋倍數(shù)標(biāo)準(zhǔn)管光密度

7、fb：血漿蛋白結(jié)合率；Dt：血藥總濃度（透析袋內(nèi)血漿藥物濃度）；Df：游離藥物濃度（透析袋外緩沖液中藥)；【實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】1.由于實(shí)驗(yàn)過程中雞和兔的采血量分別有限，所以每人只做了一種血樣。本人開始做的是兔的血樣，磺胺藥物濃度為0.025M，但在透析平衡后，吸出袋外透析液少許，加等量磺基水楊酸試劑，檢查有白色沉淀析出，則說明有血漿蛋白漏出，所以該樣品作廢。分析原因有以下幾點(diǎn)：1）裝透析液的廣口瓶不干凈，造成污染。2）用于給袋外透析液加入磺胺藥溶液的注射器不干凈，前面實(shí)驗(yàn)可能吸入過血樣，造成后面的蛋白沉淀。3）在打開