酶的分離純化方法介紹

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1、酶的分離純化方法介紹酶的分離純化一般包括三個(gè)基本步驟：即抽提、純化、結(jié)晶或制劑。首先將所需的酶從原料中引入溶液，此時(shí)不可避免地夾帶著一些雜質(zhì)，然后再將此酶從溶液中選擇性地分離出來(lái)，或者從此溶液中選擇性地除去雜質(zhì)，然后制成純化的酶。關(guān)鍵詞：酶?抽提?純化?結(jié)晶?制劑?細(xì)胞破碎cell?disruption?鹽析?親和沉淀?有機(jī)溶劑沉淀生物細(xì)胞產(chǎn)生的酶有兩類(lèi)：一類(lèi)由細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后分泌到細(xì)胞外進(jìn)行作用的酶，稱(chēng)為細(xì)胞外酶。這類(lèi)酶大都是水解酶，如酶法生產(chǎn)葡萄糖所用的兩種淀粉酶，就是由枯草桿菌和根酶發(fā)酵過(guò)程中分泌的。這類(lèi)酶一

2、般含量較高，容易得到；另一類(lèi)酶在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后并不分泌到細(xì)胞外，而在細(xì)胞內(nèi)起催化作用，稱(chēng)為細(xì)胞內(nèi)酶，如檸檬酸、肌苷酸、味精的發(fā)酵生產(chǎn)所進(jìn)行的一系列化學(xué)反應(yīng)，就是在多種酶催化下在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的，在類(lèi)酶在細(xì)胞內(nèi)往往與細(xì)胞結(jié)構(gòu)結(jié)合，有一定的分布區(qū)域，催化的反應(yīng)具有一定的順序性，使許多反應(yīng)能有條不紊地進(jìn)行。酶的來(lái)源多為生物細(xì)胞。生物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的總的酶量雖然是很高的，但每一種酶的含量卻很低，如胰臟中期消化作用的水解酶種類(lèi)很多，但各種酶的含量卻差別很大。因此，在提取某一種酶時(shí)，首先應(yīng)當(dāng)根據(jù)需要，選擇含此酶最豐富的材料，如胰臟是

3、提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于從動(dòng)物內(nèi)臟或植物果實(shí)中提取酶制劑受到原料的限制，如不能綜合利用，成本又很大。目前工業(yè)上大多采用培養(yǎng)微生物的方法來(lái)獲得大量的酶制劑。從微生物中來(lái)生產(chǎn)酶制劑的優(yōu)點(diǎn)有很多，既不受氣候地理?xiàng)l件限制，而且動(dòng)植物體內(nèi)酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，產(chǎn)酶量又豐富，還可以通過(guò)選育菌種來(lái)提高產(chǎn)量，用廉價(jià)原料可以大量生產(chǎn)。由于在生物組織中，除了我們所需要的某一種酶之外，往往還有許多其它酶和一般蛋白質(zhì)以及其他雜質(zhì)，因此為制取某酶制劑時(shí)，必須經(jīng)過(guò)分純化的手續(xù)。酶是具有催化活

4、性的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)很容易變性，所以在酶的提純過(guò)程中應(yīng)避免用強(qiáng)酸強(qiáng)堿，保持在較低的溫度下操作。在提純的過(guò)程中通過(guò)測(cè)定酶的催化活性可以比較容易跟蹤酶在分離提純過(guò)程中的去向。酶的催化活性又可以作為選擇分離純化方法和操作條件的指標(biāo)，在整個(gè)酶的分離純化過(guò)程中的每一步驟，始終要測(cè)定酶的總活力和比活力，這樣才能知道經(jīng)過(guò)某一步驟回收到多少酶，純度提高了多少，從而決定著一步驟的取舍。酶的分離純化一般包括三個(gè)基本步驟：即抽提、純化、結(jié)晶或制劑。首先將所需的酶從原料中引入溶液，此時(shí)不可避免地夾帶著一些雜質(zhì)，然后再將此酶從溶液中選擇性

5、地分離出來(lái)，或者從此溶液中選擇性地除去雜質(zhì)，然后制成純化的酶制劑。下面就酶的分離純化的常用方法作一綜合介紹：一、預(yù)處理及固液分離技術(shù)1.細(xì)胞破碎（celldisruption）高壓均質(zhì)器法：此法可用于破碎酵母菌、大腸菌、假單胞菌、桿菌甚至黑曲霉菌。將細(xì)胞懸浮液在高壓下通入一個(gè)孔徑可調(diào)的排放孔中，菌體從高壓環(huán)境轉(zhuǎn)到低壓環(huán)境，細(xì)胞就容易破碎。菌懸液一次通過(guò)均質(zhì)器的細(xì)胞破碎率在12%-67%。細(xì)胞破碎率與細(xì)胞的種類(lèi)有關(guān)。要達(dá)到90%以上的細(xì)胞破碎率，起碼要將菌懸液通過(guò)均質(zhì)器兩次。最好是提高操作壓力，減少操作次數(shù)。但有

6、人報(bào)道，當(dāng)操作壓力達(dá)到175Mpa時(shí)，破碎率可達(dá)100%。當(dāng)壓力超過(guò)70Mpa時(shí)，細(xì)胞破碎率上升較為緩慢。高壓均質(zhì)器的閥門(mén)是影響細(xì)胞破碎率的重要因素。絲狀菌會(huì)堵塞均質(zhì)器的閥門(mén)，尤其高濃度菌體時(shí)更是如此。在豐富培養(yǎng)基上比在合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的大腸菌更難破碎。容菌酶處理法：蛋清中含有豐富的溶菌酶，價(jià)格便宜，常用來(lái)裂解細(xì)胞。具體做法是：溶壁微球菌(micrococcuslysodeikticus)43kg，置于0.5%的氯化鈉溶液中，使細(xì)胞濃度為5%（干重），在35℃用0.68kg（干重）的蛋清處理20min，得到的細(xì)

7、胞碎片用相同體積的乙醇處理，用離心機(jī)將細(xì)胞碎片和胞內(nèi)蛋白質(zhì)除去，再將乙醇濃度提高到75%（體積分?jǐn)?shù)），可以得到純度為5%的過(guò)氧化氫酶1500g。2.離心離心分離過(guò)程可分為離心過(guò)濾、離心沉淀、離心分離3種類(lèi)型，所使用的設(shè)備有過(guò)濾式離心機(jī)、沉降式離心機(jī)和離心機(jī)。過(guò)濾式離心機(jī)的轉(zhuǎn)鼓壁上開(kāi)有小孔，壁上有過(guò)濾介質(zhì)，一般可用于處理懸浮固體顆粒較大、固體含量較高的場(chǎng)合。沉降式離心機(jī)用于分離固體濃度較低的固液分離，如發(fā)酵液中的菌體，用鹽析法或有機(jī)溶劑處理過(guò)的蛋白質(zhì)等。分離機(jī)用于分離兩種互不相溶的、密度有微小差別的乳濁液或含微量

8、固體微粒的乳濁液。在生物領(lǐng)域采用的離心機(jī)系統(tǒng)，除了應(yīng)具備離心機(jī)的一般要求外，還應(yīng)滿(mǎn)足生物生產(chǎn)的技術(shù)要求，這包括滅菌、冷卻、密封，以保證產(chǎn)品不受污染并不污染環(huán)境?，F(xiàn)代哦離心機(jī)裝置包括以下三個(gè)步驟，并進(jìn)行程序控制：離心、離心系統(tǒng)的滅菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司離心機(jī)產(chǎn)品的裝置，具有雙重軸向密封，密封由裝在轉(zhuǎn)筒主軸上下的碳化硅動(dòng)環(huán)和固定環(huán)組成，密封由水連續(xù)冷卻和潤(rùn)滑，可防止產(chǎn)品被污染，也可