人抗中性粒細胞胞漿抗體(canca) igm酶聯(lián)免疫分析

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1、人抗中性粒細胞胞漿抗體(cANCA)IgM酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用產(chǎn)品編號：CSB-E12779h最低檢測限：1ng/ml特異性：本試劑盒可同時檢測人cANCA(IgM)，且與其他相關(guān)抗體無交叉反應(yīng)。有效期：6個月預(yù)期應(yīng)用：ELISA法半定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中cANCA(IgM)含量。說明1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。3．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，

2、不會對實驗結(jié)果造成任何影響。實驗原理用中性粒細胞胞漿包被酶標(biāo)板，制成固相載體。向微孔中先加入待測樣品進行反應(yīng)，然后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgM進行反應(yīng)，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的cANCA(IgM)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品中抗體的效價（抗血清最終能顯色的最高稀釋倍數(shù)記為效價）。試劑盒組成及試劑配制1.酶聯(lián)板(Assayplate)：一塊（96孔）。2.樣品稀釋液(SampleDiluent)：1×20ml/瓶。3.辣根過氧化物酶

3、標(biāo)記抗人IgM稀釋液?（HRP-anti-humanIgMDiluent）：1×10ml/瓶。4.辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgM（HRP-anti-humanIgM）：1×120μl/瓶（1：100）。5.底物溶液（TMBSubstrate）：1×10ml/瓶。6.濃洗滌液（WashBuffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。7.終止液（StopSolution）：1×10ml/瓶（2NH2SO4）。需要而未提供的試劑和器材1.標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀2.高速離心機3.電熱恒溫培養(yǎng)箱4.干凈的試管和Eppendof管5.系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時

4、，最好用多通道移液器6.蒸餾水，容量瓶等標(biāo)本的采集及保存1.血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或室溫過夜后于1000xg離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。2.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2-8°C1000xg離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。3.細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000xg離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。注：標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。標(biāo)本的稀釋原則：首先通過文獻檢

5、索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細的記錄。最后計算抗體效價時，稀釋了“N”倍，標(biāo)本中抗體的效價為“N”。辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgM的稀釋原則：臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgM稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgM加990μl辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgM稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。操作步驟實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。如樣品濃度過高時，用樣

6、品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。1.加樣：分別設(shè)空白孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔加待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgM工作液100μl（取1μl生物素標(biāo)記抗體加99μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃，60分鐘。3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。4.依序每孔加底物溶液90μ

7、l，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見孔內(nèi)有明顯藍色，即可終止）。5.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。6.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。注：1.用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。2.每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。3.為防止樣品蒸