引物合成知識資料-賽百盛,金斯瑞

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1、化學(xué)合成的Oligo用于克隆須知（賽百盛）不管化學(xué)合成的OligoDNA為短片段還是長片段，只要用于PCR克隆，最好對OligoDNA粗制品進行純化。盡管如此，客戶還是須考慮如下風(fēng)險：????1.內(nèi)部缺失（n-1，n-2etc）產(chǎn)物。這是化學(xué)合成DNA最普遍與最主要的限制因素，且不能通過純化OligoDNA來解決這個問題?；瘜W(xué)合成DNA不及活細胞內(nèi)DNA復(fù)制具有高保真性，在活細胞內(nèi)，存在大量的校正與修復(fù)系統(tǒng)，將堿基突變率降低至1/(1×106)甚至1/(1×109)以下。PCR反應(yīng)也具有較高的保真度，例如：錯誤率在1/1000或1/10000。PCR反應(yīng)

2、可通過DNA聚合酶的性能提高保真度。但是化學(xué)合成DNA與活細胞及PCR反應(yīng)擴增DNA不同，每次合成循環(huán)的錯誤率約為1/100，主要包括以下幾方面的因素。????(1)OligoDNA的化學(xué)合成是堿基與堿基之間通過化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)而成，而化學(xué)反應(yīng)的偶聯(lián)效率一般在99%左右，也就是說，在每次進行偶聯(lián)反應(yīng)時，都會有1%的DNA片段附加不上新的堿基，對這種截斷的失敗序列，為了防止其參與后續(xù)的偶聯(lián)反應(yīng)，采用CapA與CapB進行化學(xué)封閉，以阻斷其延伸，但化學(xué)封閉反應(yīng)的效率不可能達到100%。導(dǎo)致出現(xiàn)合成失敗的DNA片段或截斷序列殘留在合成的DNA粗制品中。????(2

3、)OligoDNA的不完全脫保護。寡核苷酸的完全脫保護包括從磷酸酯基團、堿基上的環(huán)外氨基和5'-OH部分上去掉保護基團。脫保護的化學(xué)反應(yīng)效率不可能達到100%，未脫保護的堿基無法參加偶聯(lián)反應(yīng)而導(dǎo)致oligoDNA內(nèi)部缺失堿基。????(3)不斷延長的DNA鏈與不斷減少的合成試劑會干擾oligoDNA的化學(xué)合成。????對于以上三方面問題，至今為止還沒有找到一個完美的試劑給予解決。因為延長蓋帽時間也不能保證封閉反應(yīng)效率達到100%；而對于脫保護反應(yīng)來說，增加脫保護試劑量及延長脫保護時間又會導(dǎo)致oligoDNA脫嘌呤。因此只能采取折衷方法將不完全脫保護與脫嘌

4、呤同時控制在低水平上。內(nèi)部缺失堿基的截斷序列絕不可能100%去除干凈，對于幾種純化方法來說，OPC或HPLC不可能去除內(nèi)部缺失堿基的截斷序列，最好的方法是通過PAGE純化降低截斷序列數(shù)量。????OPC與HPLC純化法是通過兩種不同形式的柱層析方法對oligoDNA進行純化，PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純化，但都不易將缺失一個堿基（n-1）或兩個堿基（n-2）的oligoDNA與全長oligoDNA分離。柱層析與PAGE對于分析檢測少量的oligoDNA是一種合適的手段，但作為純化制備目的DNA片段，并不是非常有效。因此，在合成的目的o

5、ligoDNA中，總會存在少量的截斷序列。由于這些錯誤的隨機性（不同分子有不同的堿基突變，同時多數(shù)分子沒有堿基突變），這種序列的錯誤率通常對普通PCR、測序或雜交不會存在問題，對于合成不太長的序列，更是如此。然而，克隆過程是單個oligoDNA分子的選擇與擴增過程，若單個親本分子存在序列錯誤，那么單克隆中所有分子都存在相同的序列錯誤。????2.單核苷酸的插入是存在于目的oligoDNA產(chǎn)物中的另一種常見的序列錯誤。???當同一oligoDNA分子中存在G-偶聯(lián)或單堿基插入（n+1）同時又存在單堿基缺失（n-1）時，此條oligoDNA的長度與目的DNA

6、分子的長度相同，因此無法通過OPC、HPLC或PAGE純化將此“失敗序列”去除。????3.OPC、HPLC特別是PAGE是產(chǎn)率損耗很大的純化方法，因此會導(dǎo)致低產(chǎn)量（OPC與HPLC的得率約為30%~50%，PAGE的得率約為10%~30%），主要的原因是大量的目的oligoDNA分子（全長與正確的OligoDNA）在純化過程中會隨著失敗序列一起被去除。????OligoDNA化學(xué)合成存在的這些弊端曾被HeckerKH與RillR報道過（Erroranalysisofchemicallysynthesizedpolynucleotides.Biotech

7、niques,1998Feb;24:256-260）。在這篇文章中，作者合成并PAGE純化了長鏈oligoDNA，用它們進行PCR克隆，然后測序鑒定了10個克隆，發(fā)現(xiàn)存在7個單堿基缺失，一個連續(xù)的4個堿基缺失，一個G-C替換。除了這些堿基錯誤，其它學(xué)者還曾報道存在G-偶聯(lián)、分支及其n+x產(chǎn)物。????解決這些堿基出錯的方法：??（1）對oligoDNA粗制品進行純化。不僅要通過OPC、HPLC、PAGE等方法對OligoDNA進行純化，而且需要優(yōu)化化學(xué)合成方法來提高OligoDNA的純度。???（2）當OPC、PAGE或HPLC純化的OligoDNA用于

8、PCR克隆時，可能會存在一些序列錯誤的“突變”克?。ㄟ@些堿基錯誤的克隆可能源于O