引物合成知識資料-賽百盛,金斯瑞

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1、化學(xué)合成的Oligo用于克隆須知（賽百盛）不管化學(xué)合成的OligoDNA為短片段還是長片段，只要用于PCR克隆，最好對OligoDNA粗制品進行純化。盡管如此，客戶還是須考慮如下風(fēng)險：????1.內(nèi)部缺失（n-1，n-2etc）產(chǎn)物。這是化學(xué)合成DNA最普遍與最主要的限制因素，且不能通過純化OligoDNA來解決這個問題。化學(xué)合成DNA不及活細胞內(nèi)DNA復(fù)制具有高保真性，在活細胞內(nèi)，存在大量的校正與修復(fù)系統(tǒng)，將堿基突變率降低至1/(1×106)甚至1/(1×109)以下。PCR反應(yīng)也具有較高的保真度，例如：錯誤率在1/1000或1/10000。PCR反應(yīng)可通過DNA聚合酶的性能提高保真度。但是

2、化學(xué)合成DNA與活細胞及PCR反應(yīng)擴增DNA不同，每次合成循環(huán)的錯誤率約為1/100，主要包括以下幾方面的因素。????(1)OligoDNA的化學(xué)合成是堿基與堿基之間通過化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)而成，而化學(xué)反應(yīng)的偶聯(lián)效率一般在99%左右，也就是說，在每次進行偶聯(lián)反應(yīng)時，都會有1%的DNA片段附加不上新的堿基，對這種截斷的失敗序列，為了防止其參與后續(xù)的偶聯(lián)反應(yīng)，采用CapA與CapB進行化學(xué)封閉，以阻斷其延伸，但化學(xué)封閉反應(yīng)的效率不可能達到100%。導(dǎo)致出現(xiàn)合成失敗的DNA片段或截斷序列殘留在合成的DNA粗制品中。????(2)OligoDNA的不完全脫保護。寡核苷酸的完全脫保護包括從磷酸酯基團、堿基上的

3、環(huán)外氨基和5'-OH部分上去掉保護基團。脫保護的化學(xué)反應(yīng)效率不可能達到100%，未脫保護的堿基無法參加偶聯(lián)反應(yīng)而導(dǎo)致oligoDNA內(nèi)部缺失堿基。????(3)不斷延長的DNA鏈與不斷減少的合成試劑會干擾oligoDNA的化學(xué)合成。????對于以上三方面問題，至今為止還沒有找到一個完美的試劑給予解決。因為延長蓋帽時間也不能保證封閉反應(yīng)效率達到100%；而對于脫保護反應(yīng)來說，增加脫保護試劑量及延長脫保護時間又會導(dǎo)致oligoDNA脫嘌呤。因此只能采取折衷方法將不完全脫保護與脫嘌呤同時控制在低水平上。內(nèi)部缺失堿基的截斷序列絕不可能100%去除干凈，對于幾種純化方法來說，OPC或HPLC不可能去除內(nèi)

4、部缺失堿基的截斷序列，最好的方法是通過PAGE純化降低截斷序列數(shù)量。????OPC與HPLC純化法是通過兩種不同形式的柱層析方法對oligoDNA進行純化，PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純化，但都不易將缺失一個堿基（n-1）或兩個堿基（n-2）的oligoDNA與全長oligoDNA分離。柱層析與PAGE對于分析檢測少量的oligoDNA是一種合適的手段，但作為純化制備目的DNA片段，并不是非常有效。因此，在合成的目的oligoDNA中，總會存在少量的截斷序列。由于這些錯誤的隨機性（不同分子有不同的堿基突變，同時多數(shù)分子沒有堿基突變），這種序列的錯誤率通常對普通PCR、測序或雜

5、交不會存在問題，對于合成不太長的序列，更是如此。然而，克隆過程是單個oligoDNA分子的選擇與擴增過程，若單個親本分子存在序列錯誤，那么單克隆中所有分子都存在相同的序列錯誤。????2.單核苷酸的插入是存在于目的oligoDNA產(chǎn)物中的另一種常見的序列錯誤。???當(dāng)同一oligoDNA分子中存在G-偶聯(lián)或單堿基插入（n+1）同時又存在單堿基缺失（n-1）時，此條oligoDNA的長度與目的DNA分子的長度相同，因此無法通過OPC、HPLC或PAGE純化將此“失敗序列”去除。????3.OPC、HPLC特別是PAGE是產(chǎn)率損耗很大的純化方法，因此會導(dǎo)致低產(chǎn)量（OPC與HPLC的得率約為30%~

6、50%，PAGE的得率約為10%~30%），主要的原因是大量的目的oligoDNA分子（全長與正確的OligoDNA）在純化過程中會隨著失敗序列一起被去除。????OligoDNA化學(xué)合成存在的這些弊端曾被HeckerKH與RillR報道過（Erroranalysisofchemicallysynthesizedpolynucleotides.Biotechniques,1998Feb;24:256-260）。在這篇文章中，作者合成并PAGE純化了長鏈oligoDNA，用它們進行PCR克隆，然后測序鑒定了10個克隆，發(fā)現(xiàn)存在7個單堿基缺失，一個連續(xù)的4個堿基缺失，一個G-C替換。除了這些堿基錯

7、誤，其它學(xué)者還曾報道存在G-偶聯(lián)、分支及其n+x產(chǎn)物。????解決這些堿基出錯的方法：??（1）對oligoDNA粗制品進行純化。不僅要通過OPC、HPLC、PAGE等方法對OligoDNA進行純化，而且需要優(yōu)化化學(xué)合成方法來提高OligoDNA的純度。???（2）當(dāng)OPC、PAGE或HPLC純化的OligoDNA用于PCR克隆時，可能會存在一些序列錯誤的“突變”克隆（這些堿基錯誤的克隆可能源于O