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《蔗糖酶的提取、分離、純化及活性檢測(cè)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、蔗糖酶的提取、分離、純化及活性檢測(cè)摘要隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，不論對(duì)酶分子本身作用機(jī)制的研究還是其他研究，越來(lái)越需要純度更高的酶制劑，這就要求我們熟悉酶提純的一般操作步驟及酶的提純及活力測(cè)定等重要的生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)。本次實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)提取啤酒酵母中的蔗糖酶并經(jīng)過(guò)兩次純化測(cè)定其活力與Km。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用乙醇分級(jí)分離法，DEAE-Cellulose柱層析，分子篩（凝膠過(guò)濾）層析提取純化蔗糖酶。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，雖然我們很努力,但由于我們對(duì)實(shí)驗(yàn)的程序不熟悉，因此在實(shí)驗(yàn)的一些過(guò)程中有一些明顯的操作失誤，使得實(shí)驗(yàn)的最后測(cè)定結(jié)果與理論值有一定出入。關(guān)鍵詞啤酒酵母蔗糖酶乙醇分級(jí)分離
2、DEAE-Cellulose柱層析分子篩層析Km前言生物體內(nèi)所發(fā)生的一切化學(xué)反應(yīng)，幾乎都是在專一性酶的催化下進(jìn)行的，因此酶的研究對(duì)了解生命活動(dòng)的規(guī)律以及生命本質(zhì)的闡述具有十分重要的意義。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，不論對(duì)酶分子本身作用機(jī)制的研究以及分子生物學(xué)其他重要課題的研究都越來(lái)越多地需要使用作用專一，純度高的酶制劑。這就要求人們建立各種方法，以便從各種生物來(lái)源的材料中分離提純酶。由于酶本身也是蛋白質(zhì)，因此酶分離提存的方法大體上與蛋白質(zhì)純化方法相同，一般來(lái)說(shuō)，沒(méi)有一種固定的方法，而往往根據(jù)實(shí)驗(yàn)者所要分離提純酶的取材以及酶本身的物理﹑化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)來(lái)確定分離提
3、純方法。各種酶的純化通常有五個(gè)階段：①材料的選擇與預(yù)處理；②細(xì)胞破碎；③抽提；④純化；⑤濃縮﹑干燥及保存。酶分離純化成功與否的重要標(biāo)志：一是要有較高的收率；二是達(dá)到所要求的純度，這兩個(gè)指標(biāo)通常是矛盾的，可根據(jù)需要來(lái)有所側(cè)重，一般來(lái)說(shuō)，好的方法與步驟應(yīng)該是簡(jiǎn)單易行，最終的酶制劑有較高的收率和純度。就單獨(dú)的每種分離提純的方法而言，有鹽析法、有機(jī)溶劑分級(jí)法、調(diào)PH分級(jí)沉淀法、選擇變性法、吸附法、層析法（紙層析、薄板層析、柱層析等）。其中鹽析法是用于蛋白質(zhì)和酶分離提純的最早而且最廣泛的一種方法，該方法是根據(jù)蛋白質(zhì)和酶在一定濃度的溶液中溶解度的降低程度的不同而達(dá)到彼
4、此分離的方法鹽析法常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等，其中用得最多的是硫酸銨，因?yàn)樗哂袦囟认禂?shù)小而溶解度大的優(yōu)點(diǎn)。在一定的溶解度范圍內(nèi)許多蛋白質(zhì)和酶均可鹽析出來(lái)。其次，它的價(jià)格便宜，分級(jí)效果好且不容易引起蛋白質(zhì)變性，在一定程度上還有穩(wěn)定作用。有機(jī)溶劑沉淀法能降低溶液的介電常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的斥力，導(dǎo)致溶解度的降低。另外，有機(jī)溶劑與水作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，故蛋白質(zhì)在一定濃度的有機(jī)溶液中便沉淀析出。在分離純化的過(guò)程中，往往需要幾種方法的合理結(jié)合，方法選擇的好，前后串聯(lián)得當(dāng)，可大大提高整個(gè)分離提純過(guò)程的速度和收效。在分
5、離提純過(guò)程中，應(yīng)該盡量避免引起蛋白質(zhì)變性的各種因素，此外，在分離提純前，必須建立對(duì)酶的分析鑒定方法，以正確指導(dǎo)分離提純地進(jìn)行。材料與方法1.材料啤酒酵母（蘭州黃河啤酒有限公司）2．方法及步驟2.1葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取22支編號(hào)的試管（兩個(gè)平行）按下表的順序加入0.2%Glc溶液，水及3,5-二硝基水楊酸試劑。然后在沸水浴中加熱5分鐘，然后立即用自來(lái)水冷卻并用蒸餾水定容至25ml，搖勻，于540nm測(cè)光密度，結(jié)果如下表所示：管號(hào)含糖量水（ml）OD540nm（ug）BG溶液0.2%Glc標(biāo)準(zhǔn)液（ml）3.5-二硝基水楊酸試劑（ml）平均OD540nm
6、10.00.02.01.50.00.00.020.40.21.81.50.0650.0730.06930.80.41.61.50.1530.1670.16041.20.61.41.50.2570.1850.22151.60.81.21.50.3460.3340.34062.01.01.01.50.4430.4290.43672.41.20.81.50.5080.5060.50782.81.40.61.50.5940.6020.59893.21.60.41.50.6690.6580.664103.61.80.21.50.7660.7530.760114.02
7、.00.01.50.8500.8180.8342.2標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的制作取11支編號(hào)的試管，分別準(zhǔn)確加入如下表所示的牛血清白蛋白溶液，然后分別加入1.5ml考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白染色試劑，搖勻，放置3min后，在595nm比色讀取OD值，結(jié)果如下表所示：試管號(hào)012345678910標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度（ug/ml）020406080100120140160180200牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0水（ml）1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.101.51.51.51.51.51.51
8、.51.51.51.51.5考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白染色試劑（ml
