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1、實驗六酵母蔗糖酶的提取及純化原理鹿糖酶(invertase)(?—D—呋喃果糖苷果糖水解酶)(fructofuranosidefructohydrolase)(EC.3.2.1.26)特異地催化非還原糖屮的?一呋喃果糖苷鍵水解，具有相對專一性。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解lmol蔗糖，就生成2mol還原糖。還原糖的測定有多種方法，本實驗采用Nelson比色法測定還原糖量,由此可得知蔗糖水解的速度。+H20在研宄酶的性質、作用、反應動力學等問題時都需要使用高度純化的酶制劑以避免干擾。酶的
2、提純工作往往要求多種分離方法交替應用，才能得到較為滿足的效果。常用的提純方法有鹽析、有機溶劑沉淀、選擇性變性、離子交換層析、凝膠過濾、親和層析等。酶蛋白在分離提純過程中易變性失活，為能獲得盡可能高的產(chǎn)率和純度，在提純操作中要始終注意保持酶的活性如在低溫下操作等，這樣才能收到較好的分離效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量豐富。本實驗用新鮮啤酒酵母為原料，通過破碎細胞，熱處理，乙醇沉淀，柱層析等步驟提取蔗糖酶，并對其性質進行測定。蔗糖酶0HH0一、蔗糖酶的提取與部分純化(一)實驗目的學習酶的提取和純化方法，掌握各步驟的實驗原理，并為后續(xù)實驗提供一定
3、量的蔗糖酶。（二）實驗原理（略）（三）實驗儀器、材料及試劑儀器1.高速冷凍離心機、恒溫水浴箱、一2（rc冰箱2.電子天平、研缽（〉200ml）、制冰機、50ml燒杯3.離心管（2ml，10ml,30ml或50ml）、移液器（lOOOul）或滴管、量筒材料及試劑1.市售鮮啤灑酵母（低溫保存）2.石英砂（海沙）、甲苯（使用前預冷到or以下）3.95%乙醇（預冷一20°C）、去離子水（使用前冷至4°C左右）4.Tris-HCI（pH7.3）緩沖液（四）操作步驟1.提?。?）將市售鮮啤酒酵母2000rpm，離心lOmin,除去大量水分。（2）將
4、研缽穩(wěn)妥放入冰浴中。（3）稱取50g鮮啤酒酵母，加30g石英砂放入研缽中，加50ml預冷的甲苯（邊研邊加）或預冷的去離子水，在研缽內研磨成糊狀，然后每次緩慢加入預冷的10ml去離子水，邊加邊研磨以便將蔗糖酶充分轉入水相。共加75ml去離子水，研磨約40?60分鐘，使其成糊狀液體。（注：研磨時可用顯微鏡檢查研磨的效果，至酵母細胞人部分研碎）。(4)將混合物轉入50ml(或分裝入2個30ml)離心管中，平衡后，用高速冷凍離心機離心，4°C,15000rpm，15min。觀察結果：如果屮間白色的脂肪層厚，說明研磨效果良好。(4)用移液器(或滴
5、管)吸出上層有機相(棄棹)。(5)用移液器小心地取出脂肪層下面的水相液轉入量筒，量出體積，并記錄。(6)取出2ml放入2ml離心管中(標記為粗級分I，一20°C下保存)，用于測定酶活力及蛋白含量。剩余部分轉入清潔的小燒杯中。1.熱處理(1)將盛有粗級分I的小燒杯迅速地放入50°C恒溫水浴屮，保持30分鐘，并用玻璃棒溫和攪動。(2)取出小燒杯，迅速用冰浴冷卻，轉入清潔的離心管中(根據(jù)量大小選擇離心管),4°C,15000rpm,離心15min。(3)將上清液轉入量筒，量出體積，并記錄。(4)取出2ml放入2ml離心管中(標記為熱級分II，
6、一20°C下保存)，用于測定酶活力及蛋白含量。剩余部分轉入清潔的小燒杯中。2.乙醇沉淀(1)將盛有熱處理后的上清液放入小燒杯，在冰浴下逐滴加入預冷的等體積(逐滴加入)95%乙醇，溫和攪拌、放置，需1小時。(2)轉入清潔的離心管屮，用4°C,15000rpm,離心15min,傾去上清，并滴干。(1)離心管中沉淀用5?8mlTris-HCI(pH7.3)緩沖液充分溶解(若溶液混濁，則用離心管，4000rpm離心除去不溶物），轉入量簡，量出體積，并記錄。（4）取出2ml放入2ml離心管中（標記為醇級分III,一2（TC下保存），用于測定酶活力
7、及蛋白含量。剩余部分轉入清潔的小燒杯中，用于下一步實驗。（注：離心管屮沉淀也可蓋上蓋子或薄膜封門，然后將其放入冰箱中冷凍保存，用時再處理）（五）實驗結果與分析記錄實驗結果，并加以解釋，若有異常現(xiàn)象出現(xiàn)，可進行分析討論。（六）注意事項二、蔗糖酶活性及蛋白質濃度的測定（一）實驗目的學會用考馬斯亮藍結合法測定蛋白質濃度，用Nelson方法測定酶活力。掌握各步驟的實驗原理和方法。（二）實驗原理本實驗以Nelson方法測定酶活力，其原理是還原糖含有的自由醛基或酮基，在堿性溶液中將Cu2+還原成氧化亞銅，糖本身被氧化成羥酸，砷鉬酸試劑與氧化亞銅生成
8、藍色溶液，在510nm下有正比于還原糖的吸收，從而可確定酶的活力，測定范圍：25^200ugo本實驗用考馬斯亮藍結合法測定蛋0濃度，考馬斯亮藍能與蛋0質的疏水微區(qū)相結合，這種結合具有高敏感性。考馬斯亮藍G2
