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1、酵母蔗糖酶提取方法的研究生命科學(xué)學(xué)院10級生物科學(xué)類李倩10197022指導(dǎo)老師:陶芳摘要:采用自溶法從酵母中提取蔗糖酶,通過抽提、30﹪乙醇分級、50﹪乙醇分級和透析,同時(shí)測定各步的蛋白質(zhì)濃度和酶活,并據(jù)此計(jì)算比活、回收率和純化倍數(shù)。關(guān)鍵詞:蔗糖酶提取自溶法ResearchontheExtractionMethodofYeastSucroseSchoolofLifeSciences,BiologicalSciencesofgrade2,liQian,10197022Abstract:Theautol
2、ysisextractfromyeastinvertase,throughextraction,30ethanolfractionationanddialysis,simultaneousdeterminationofeachstepofconcertrationofproteinandenzymeavtivity,andthencalculatetheradiooflive,recoveryandpurification.Keywords:yeast;extraction;autolysismeth
3、od前言:蔗糖酶(Sucrase,EC3.2.1.26)又稱轉(zhuǎn)化酶(Invertase),1928年Dumas等首先指出酵母菌發(fā)酵蔗糖時(shí)必須有這種酶的存在,蔗糖在蔗糖酶的作用下,水解為葡萄糖和果糖,還原力增加,又由于生成果糖,甜度增加。按水解蔗糖的方式,蔗糖酶可分為從果糖末端切開蔗糖的β-D-呋喃果糖苷酶(β-D-frutofuranosidases,EC3.2.1.26)和從葡萄糖末端切開蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶(α-D-glucosidases,EC3.2.1.20)。前者存在于酵母中,后者存在于
4、霉菌中。工業(yè)上多從酵母中提取。蔗糖酶在工業(yè)上用以轉(zhuǎn)化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高濃度糖漿中的蔗糖析出,還用來制造含果糖和巧克力的軟心糖等。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谟米匀芊ㄌ崛〗湍刚崽敲傅倪^程中,測定各步的總蛋白、總活力,并據(jù)此計(jì)算比活、回收率和純化倍數(shù)。1.材料與方法1.1材料與儀器1.1.1材料酵母粉(市售)。1.1.2儀器離心機(jī);722分光光度計(jì);水浴鍋等。1.1.3試劑牛血清蛋白;3,5-二硝基水楊酸試劑;考馬斯亮藍(lán)G-250;磷酸緩沖液(0.005mol/LpH6.0)等。1.2方法1.2.1蔗
5、糖酶粗品的制備將5g酵母粉倒入500ml燒杯中、少量多次地加入15ml蒸餾水,攪拌均勻,成糊狀后加入0.5g乙酸鈉、8ml乙酸乙酯,攪勻,再于35℃恒溫水浴中攪拌30min。補(bǔ)加10ml蒸餾水后,攪勻蓋嚴(yán),35℃恒溫過夜后,4000r/min離心10min,得到的上清液即為粗制酶液。1.2.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度成一定比例關(guān)系,可用于比色測定。采用DNS比色法測定還原糖的含量,同時(shí)可測定酶活。取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品,用緩沖液配置成一定梯度濃度的溶液,與DNS顯色后在52
6、0nm測定吸光值。表1葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作項(xiàng)目空白123456含糖總量mg00.81.21.62.02.42.8葡萄糖液ml00.40.60.81.01.21.4蒸餾水ml2.01.61.41.21.00.80.6DNS試劑ml3333333加熱均在沸水浴中加熱5min冷卻立即用流動(dòng)冷水冷卻蒸餾水ml20202020202020光密度OD520nm以葡萄糖含量(mg)為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=0.0746x+0.0024。1.2.3蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的
7、制定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定蛋白質(zhì)濃度。取標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白,用生理鹽水配置一定梯度濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)蛋白液,與G-250作用后在595nm測定吸光值。表2蛋白質(zhì)定量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線制作溶液0管1管2管3管4管5管留樣1留樣1’系列標(biāo)準(zhǔn)蛋白液ml_0.20.40.60.81.00.50.5實(shí)際蛋白質(zhì)含量μg_20406080100__0.9%生理鹽水ml1.00.80.60.40.2___蛋白質(zhì)染色液ml5.05.05.05.05.05.05.05.0輕輕搖勻,5min后以0號管調(diào)空白,595nm分光光
8、度法測光密度值,匯出標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知樣品從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)濃度經(jīng)測定,得表3蛋白質(zhì)含量與光密度值測定結(jié)果試管號012345實(shí)際蛋白質(zhì)含量(mg)_20406080100OD(595)00.1420.3550.4550.6540.787以蛋白質(zhì)含量(mg)為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。獲得的蛋白質(zhì)曲線方程為:y=7.945x+0.0019。從上述公式可知,吸光值和蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)。1.2.4蛋白質(zhì)濃度測定從留樣中取0.3ml加0.9%的Nacl