酵母蔗糖酶的提取及其性質(zhì)研究

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1、1、學(xué)習(xí)酶的純化方法，酶蛋白分離提純的原理。2、學(xué)習(xí)掌握細(xì)胞破壁、有機(jī)溶劑分級(jí)和離子交換柱層析技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)可以為大家提供一個(gè)較全面的實(shí)踐機(jī)會(huì)，學(xué)習(xí)如何提取純化、分析鑒定一種酶，并對(duì)這種酶的性質(zhì)，尤其是動(dòng)力學(xué)性質(zhì)作初步的研究。酵母蔗糖酶的提取及其性質(zhì)研究自1860年Bertholet從啤酒酵母（SacchacomycesCerevisiae）中發(fā)現(xiàn)了蔗糖酶以來(lái)，它已被廣泛地進(jìn)行了研究。蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶）（EC.3.2.1.26）特異地催化非還原糖中的β-呋喃果

2、糖苷鍵水解，具有相對(duì)專一性。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)提取啤酒酵母中的蔗糖酶。該酶以兩種形式存在于酵母細(xì)胞膜的外側(cè)和內(nèi)側(cè)，在細(xì)胞膜外細(xì)胞壁中的稱之為外蔗糖酶，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50%糖成分的糖蛋白。在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)細(xì)胞質(zhì)中的稱之為內(nèi)蔗糖酶，含有少量的糖。兩種酶的蛋白質(zhì)部分均為雙亞基，二聚體，兩種形式的酶的氨基酸組成不同，外酶每個(gè)亞基比內(nèi)酶多兩個(gè)氨基酸，Ser和Met，它們的分子量也不同，外酶約為27萬(wàn)(或22萬(wàn)，與酵母的來(lái)源有

3、關(guān))，內(nèi)酶約為13.5萬(wàn)。盡管這兩種酶在組成上有較大的差別，但其底物專一性和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)仍十分相似，因此，本實(shí)驗(yàn)未區(qū)分內(nèi)酶與外酶，而且由于內(nèi)酶含量很少，極難提取，本實(shí)驗(yàn)提取純化的主要是外酶。名稱MW糖含量亞基為蔗糖的Km為棉子糖的KmpI最適pH穩(wěn)定pH最適溫度外酶27萬(wàn)50%雙26mM150mM5.04.93.0-7.560℃內(nèi)酶13.5萬(wàn)＜3%雙25mM150mM5.04.56.0-9.060℃實(shí)驗(yàn)中，用測(cè)定生成還原糖（葡萄糖和果糖）的量來(lái)測(cè)定蔗糖水解的速度，在給定的實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘水解底物的量

4、定為蔗糖酶的活力單位。比活力為每毫克蛋白質(zhì)的活力單位數(shù)。兩種酶的性質(zhì)對(duì)照表如下：一、蔗糖酶的提取與部分純化二、離子交換柱層析純化蔗糖酶三、蔗糖酶各級(jí)分活性及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定本實(shí)驗(yàn)共有三個(gè)分實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞破壁的幾種方法1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開(kāi)動(dòng)開(kāi)關(guān)后，逐步加速至所需速度。2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來(lái)回研磨，上下移動(dòng)，即可將細(xì)胞研碎，此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動(dòng)物臟器組織。3、反復(fù)凍融

5、法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。4、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料。5、化學(xué)處理法：有些動(dòng)物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細(xì)胞膜破壞，細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。6、有機(jī)溶劑沉淀法：即向水溶液中加入一定量的親水性的有機(jī)溶劑可降低溶質(zhì)的溶解度使其沉淀被析出。（一）蔗糖酶的提取與部分純化（1）準(zhǔn)備一個(gè)冰浴，將研缽穩(wěn)妥

6、放入冰浴中。（2）稱取2g干啤酒酵母，稱10mg蝸牛酶及適量（約4g）二氧化硅，放入研缽中。二氧化硅要預(yù)先研細(xì)。（3）量取預(yù)冷的甲苯12ml緩慢加入酵母中，邊加邊研磨成糊狀，約需60分鐘。研磨時(shí)用顯微鏡檢查研磨的效果，至酵母細(xì)胞大部分研碎。（4）緩慢加入預(yù)冷的20ml去離子水，每次加2ml左右，邊加邊研磨，至少用30分鐘。以便將蔗糖酶充分轉(zhuǎn)入水相。（5）將混合物轉(zhuǎn)入1個(gè)離心管中，平衡后，用高速冷凍離心機(jī)離心，4℃，4700rpm，15min。如果中間白色的脂肪層厚，說(shuō)明研磨效果良好。用滴管吸出上層有

7、機(jī)相。操作步驟（6）用滴管小心地取出脂肪層下面的水相，轉(zhuǎn)入另一個(gè)清潔的離心管中，4℃，4700rpm，離心15min。（7）將上清液轉(zhuǎn)入量筒，量出體積，留出1.5ml測(cè)定酶活力及蛋白含量。剩余部分轉(zhuǎn)入清潔離心管中。（8）用廣泛pH試紙檢查清液pH，用1M乙酸將pH調(diào)至5.0，稱為“粗級(jí)分I”。2.熱處理（1）預(yù)先將恒溫水浴調(diào)到50℃，將盛有粗級(jí)分I的離心管穩(wěn)妥地放入水浴中，50℃下保溫30分鐘，在保溫過(guò)程中不斷輕搖離心管。（2）取出離心管，于冰浴中迅速冷卻，用4℃，4700rpm，離心15min。（

8、3）將上清液轉(zhuǎn)入量筒，量出體積，留出1.5ml測(cè)定酶活力及蛋白質(zhì)含量（稱為“熱級(jí)分II”）。3.乙醇沉淀將熱級(jí)分II轉(zhuǎn)入小燒杯中，放入冰?。](méi)有水的碎冰撒入少量食鹽），逐滴加入等體積預(yù)冷至-20℃的95%乙醇，同時(shí)輕輕攪拌，共需30分鐘，再在冰浴中放置10分鐘，以沉淀完全。于4℃，4700rpm，離心15min，量出體積，留出1.5ml（下次實(shí)驗(yàn)測(cè)定酶活力）后傾去上清，沉淀用2ml0.02MpH7.3的Tris-HCl緩沖液充分溶解，保存于離心管中，蓋上蓋子，然后將其