細(xì)胞工程試驗技術(shù)操作指南

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1、細(xì)胞工程試驗技術(shù)操作指南（細(xì)胞育種）細(xì)胞工程基礎(chǔ)實驗技術(shù)1.器皿洗滌玻璃器皿洗滌：新的玻璃器皿上附有游離的堿性物質(zhì)，其洗滌方法是用1%的HCl溶液浸泡一晝夜，再用合成洗滌劑洗刷，然后用清水反復(fù)沖洗，最后用蒸餾水沖洗1～2次，干燥后即可使用。已使用過的試管、燒杯、三角瓶等的洗滌方法是，先將器皿中的殘渣除去，用清水洗凈，再用合成洗滌劑洗刷，用清水沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗1～2次。用過的吸管、滴管等內(nèi)徑狹小的玻璃制品，需先放入鉻酸洗滌液中浸泡兩小時以上，取出后經(jīng)流水沖洗半小時左右，再用蒸餾水沖洗1～2次，然后烘干或晾干。載玻片和蓋玻片容易破碎，洗滌時不宜

2、用力擦洗，其洗滌方法是先用清水沖洗，然后放入鉻酸洗滌液中浸泡幾小時或用稀鉻酸洗滌液煮沸半小時，取出后用清水沖洗干凈，將其儲藏在95%的酒精中。塑料用品洗滌：塑料用品一般用合成洗滌劑洗滌，因其附著力較強(qiáng)，因此沖洗時必須反復(fù)多次，最后用蒸餾水沖洗。金屬用品洗滌：金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌，需要清洗時，一般用酒精擦洗，并保持干燥。2.培養(yǎng)基配制2.1母液配制為工作方便起見，常用培養(yǎng)基通常先按配方配制成濃度高于實際使用濃度若干倍的母液，使用時按按比例稀釋即可。一般大量元素配制成10－20倍母液，微量元素和其它成分配制成100－200倍母液。常用的MS培

3、養(yǎng)基母液配制見附表。配好的母液需貯存于2～4℃的冰箱中，定期檢查有無沉淀和微生物污染，如果出現(xiàn)沉淀或微生物污染，則不能使用。2.2植物激素配制植物激素一般配制成濃度為0.1~1.0mg/ml的溶液，貯存在2～4℃下備用。由于多數(shù)激素難溶于水，一般按以下方法配制。IAA：先用少量95%乙醇使之充分溶解，再加蒸餾水定容至需要濃度的體積。NAA：可溶于熱水中，也可采用與IAA同樣的方法配制。2,4-D：先用少量1N的NaOH溶液充分溶解，然后緩慢加入蒸餾水定容至需要濃度體積。細(xì)胞分裂素類：KT和BA等細(xì)胞分裂素類物質(zhì)均溶于稀鹽酸，應(yīng)先用少量1N的HCl溶解

4、后再稀釋至需要濃度。赤霉素：赤霉素的水溶液穩(wěn)定性較差，一般用95%的乙醇配制成5～10mg/ml的母液低溫保存，使用時再稀釋。2.3培養(yǎng)基配制按實際配制培養(yǎng)基體積，取各母液的需要量加入一適當(dāng)體積的燒杯或其它配制培養(yǎng)基的容器中，加入實際配制培養(yǎng)基體積約2/3~3/4的蒸餾水，然后按每升所用蔗糖的量稱取相應(yīng)量的蔗糖（如1L培養(yǎng)基加20g蔗糖，若只配0.5L培養(yǎng)基，則稱取15g蔗糖）放入培養(yǎng)基中使其溶化。用1N的NaOH或1N的HCl調(diào)整pH至5.8~6.0，再按0.6~0.8%的比例加入瓊脂，并攪拌加熱使瓊脂完全溶化，然后用蒸餾水定容至終體積，混合均勻后

5、分裝于培養(yǎng)器皿（三角瓶或試管等）或其它培養(yǎng)器皿中，然后進(jìn)行高壓滅菌。3.培養(yǎng)基及實驗用具滅菌分裝好的培養(yǎng)基置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，滅菌條件為溫度121℃，壓力1.1kg/cm2，滅菌時間滅菌時間與培養(yǎng)基容量的關(guān)系見下表。如果使用人工控制的滅菌鍋，必須注意滅菌溫度的穩(wěn)定控制，因為溫度過高會引起培養(yǎng)基成分和pH的改變，而溫度過低則會造成滅菌不徹底。滅菌后的培養(yǎng)基室溫下最好在1～2周內(nèi)用完，特殊情況可貯存于4℃下1個月左右。培養(yǎng)基體積與滅菌時間的關(guān)系培養(yǎng)基體積（ml）滅菌溫度（℃）滅菌時間（min.）20－501212050－50012125500－50

6、0012535玻璃器皿可任選濕熱和干熱滅菌方法滅菌。濕熱滅菌條件與培養(yǎng)基滅菌條件一致，但要適當(dāng)延長滅菌時間，一般以25～30分鐘為宜。濕熱滅菌后器皿和包裝表面常常有水蒸氣覆蓋，如果不及時干燥常常容易微生物的再侵染，因此，器皿滅菌后應(yīng)及時放入凈化工作臺上吹干。干熱滅菌即在烘箱中加熱至160～180℃后恒溫保持40分鐘，或120℃滅菌2小時。玻璃器皿放入烘箱之前必須完全干燥，以免引起破碎，滅菌時溫度要緩慢上升，滅菌后待溫度逐漸下降到60℃以下時才能開箱門，以免器皿因突然冷縮而破碎。鑷子、剪刀、解剖刀、接種針等金屬制品，使用前和使用過程中均必須滅菌并保持無

7、菌狀態(tài)。使用前的滅菌可采用干熱滅菌。使用過程中的滅菌通常是將其浸泡在70%的酒精中，再以火焰將酒精燒去，待冷卻后使用。也可使用一種小型電熱石英砂滅菌器，代替酒精燈，每次使用完后，將用具插入消毒器的中消毒，用時取出冷卻。4.外植體滅菌a.選取生長正常、無病蟲危害的組織材料，除去多余部分后將材料整理成適當(dāng)?shù)拇笮》湃霟?。特別不潔的材料則應(yīng)先行用自來水沖洗。b.用70～75％的乙醇處理材料0.5～1min.，立即除去乙醇。c.然后在燒杯中加入消毒劑（建議使用次氯酸鈉或飽和漂白粉溶液），同時滴1～2滴土溫20。，將燒杯置于搖床上振蕩10～15min。如果材

8、料污染較嚴(yán)重或組織較老，可適當(dāng)考慮延長滅菌時間。d.將燒杯置于凈化工作臺上，棄去消毒液，用無菌水清洗3～4次