畢赤酵母表達(dá)載體及宿主菌介紹

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1、由于甲醇營養(yǎng)型酵母菌體內(nèi)無天然質(zhì)粒，所以攜帶外源基因的重組體必須整合于染色體中才能實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)。整合表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)在于保持外源基因穩(wěn)定性并可產(chǎn)生多拷貝基因。典型的畢赤氏酵母表達(dá)載體含有醇氧化酶基因的調(diào)控序列，主要的結(jié)構(gòu)包括：5’AOX1啟動(dòng)子片段、多克隆位點(diǎn)(MCS)、轉(zhuǎn)錄終止和polyA形成基因序列(TT)、篩選標(biāo)記(His4或Zeocin)、3’AOX1基因片段，作為一個(gè)能在大腸桿菌中繁殖擴(kuò)增的穿梭質(zhì)粒，它還有部分pBR322質(zhì)?；駽OLE1序列。如果是分泌型表達(dá)載體，在多克隆位點(diǎn)的前面，外源基因的5’端和啟動(dòng)子的3’端之間插人了分泌作用的信號(hào)肽序列。

2、在這個(gè)分泌信號(hào)的引導(dǎo)下，外源蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中經(jīng)修飾和加工后能夠由胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞外，將成熟的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外。為方便于操作，通常表達(dá)載體都是穿梭質(zhì)粒。表達(dá)載體與酵母染色體有單交換和雙交換整合2種方式，單交換整合時(shí)，或插入A0X1位點(diǎn)，或插入his位點(diǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道，以his4作為整合位點(diǎn)時(shí)，染色體突變株與表達(dá)盒間存在基因轉(zhuǎn)換，偶而可使Laz表達(dá)盒丟失，故AOX1位點(diǎn)更好。一般認(rèn)為，單交換轉(zhuǎn)化效率比雙交換效率高，且易得到多拷貝整合，其發(fā)生機(jī)制可能是重復(fù)單交換引起的。攜帶外源基因的表達(dá)載體可通過電穿孔、原生質(zhì)體生成法或全細(xì)胞法轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。甲醇酵母轉(zhuǎn)化和大腸

3、埃希氏菌轉(zhuǎn)化不同之處是前者較為復(fù)雜。對(duì)于大腸埃希氏菌而言，只要把重組表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞體內(nèi)即可。因其載體上攜帶有自身復(fù)制原點(diǎn)，可隨染色體復(fù)制而復(fù)制，重組表達(dá)載體能夠穩(wěn)定存在。在甲醇酵母系統(tǒng)中，所有的表達(dá)載體均不含酵母復(fù)制原點(diǎn)。這就是說，導(dǎo)入酵母體內(nèi)的重組表達(dá)載體只有和酵母染色體上的同源區(qū)發(fā)生重組，整合到染色體上，外源基因才能夠穩(wěn)定存在，外源蛋白才能得到穩(wěn)定表達(dá)，這種整合的轉(zhuǎn)化子一旦形成就非常穩(wěn)定。如果轉(zhuǎn)化后的重組表達(dá)載體未能整合到染色體上，而是以游離的附加體形式存在，這種轉(zhuǎn)化子就不穩(wěn)定，重組表達(dá)載體極易丟失。所以，載體必須整合入酵母基因組中才能實(shí)現(xiàn)異源蛋白的穩(wěn)

4、定表達(dá)。多數(shù)情況下，外源基因多拷貝整合可提高表達(dá)水平。一般可采用如下3種方法建立多拷貝表達(dá)株：①在表達(dá)載體中插入首尾相連的多拷貝表達(dá)盒；②在表達(dá)載體中插入細(xì)菌Tn903Kan基因，因G418抗性水平與載體拷貝數(shù)呈正相關(guān)；③應(yīng)用含細(xì)菌Shble基因的表達(dá)載體，如pPICZ系列，該載體較小，易擴(kuò)增，具有真光霉素抗性。1、啟動(dòng)子最常用的啟動(dòng)子是AOX1啟動(dòng)子(AOXl，promoter，PA0X)，它的甲醇誘導(dǎo)性很強(qiáng)，因而它控制下的外源基因能得到較高的表達(dá)。A0X1基因是從用RNA構(gòu)建的cDNA文庫中分離的，RNA來自克隆篩選能在甲醇培養(yǎng)基上生長的P．Pasotr

5、is細(xì)胞。P．Pasotris基因組包含2個(gè)基因：AOX1和AOX2，編碼乙醇氧化酶。在序列上這2種AOX蛋白同源性≥97％，并有相似特殊活性，但A0X1表達(dá)水平明顯高于AOX2，即啟動(dòng)能力AOX1大大強(qiáng)于AOX2。細(xì)胞中絕大多數(shù)乙醇氧化酶的活力是由A0X1提供的。當(dāng)以甲醇為唯一的生長碳源時(shí)，AOX1基因的表達(dá)被甲醇嚴(yán)格調(diào)控，并被誘導(dǎo)到相當(dāng)高的水平，可占整個(gè)細(xì)胞可溶蛋白的30％以上。AOX1和AOX2同源性雖然高達(dá)97％，但AOX2只承擔(dān)很少一部分活力。當(dāng)A0X1基因缺乏而只存在AOX2時(shí)，大部分乙醇氧化酶的活力喪失，細(xì)胞利用甲醇能力降低。因此細(xì)胞在甲醇介質(zhì)

6、上生長很慢，這種菌株被稱為Muts；A0X1基因存在時(shí)，細(xì)胞利用甲醇能力正常，在甲醇介質(zhì)上生長較快，這種菌株表型被稱為Mut+。A0X1基因的表達(dá)為轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。以甲醇為碳源時(shí)，生長細(xì)胞中約5％mRNA來自于A0X1基因。A0X1基因的調(diào)控是兩步過程：抑制機(jī)制加上誘導(dǎo)機(jī)制。即在以葡萄糖或甘油為碳源的培養(yǎng)基上生長時(shí)抑制轉(zhuǎn)錄；而在以甲醇為唯一生長碳源時(shí)，誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，蛋白表達(dá)。最近在P．Pasotris中克隆到一個(gè)組成型啟動(dòng)子：PGAP(三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子)，在它控制下的p.Lacz基因表達(dá)率比甲醇誘導(dǎo)下的以PAOX1為啟動(dòng)子的產(chǎn)量更高。由于該組成型啟動(dòng)子

7、不需甲醇誘導(dǎo)，發(fā)酵工藝更為簡(jiǎn)單，產(chǎn)量高，所以它是一個(gè)很有潛力的啟動(dòng)子。2、選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記一般為對(duì)應(yīng)于營養(yǎng)缺陷型受體的野生型基因，常用HIs4。由于P．Pasotris不利用蔗糖，所以也可用啤酒酵母的蔗糖酶基因suC2作為標(biāo)記。AMP：氨芐抗性基因，可在大腸桿菌中篩選。G418和Zeocinr(Invitrogen，sandiego，CA)也是篩選標(biāo)記，使得到高拷貝的轉(zhuǎn)化子，這是因?yàn)楸磉_(dá)載體上外源基因和卡那基因相偶聯(lián)。Zeocinr在E.coli和P.Pastoris宿主中都表達(dá)，因此縮短了穿梭載體的長度，但Zeocin是一種強(qiáng)誘變劑，可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生突變

8、。3、信號(hào)肽序列表達(dá)蛋白的分泌需要信號(hào)肽引導(dǎo)并沿一定