番茄黑斑病病原菌的鑒定及生物學(xué)特性研究

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1、番茄黑斑病病原菌的鑒定及生物學(xué)特性研究　　　番茄黑斑病是番茄常見(jiàn)的病害之一，此病是由半知菌亞門(mén)番茄鏈格孢真菌[AlternariatomatoWeber]侵染引起的，鏈格孢菌是茄科植物中危害較大的病害之一。該病不僅發(fā)生在田間，更是采后貯藏過(guò)程中的重要病害，可侵染番茄、茄子、辣椒、馬鈴薯等茄科類蔬菜，主要通過(guò)氣孔、皮孔、傷口或表皮侵入果實(shí)，在適宜的條件下產(chǎn)生大量孢子，對(duì)果實(shí)造成嚴(yán)重危害[1]。?　　研究表明，鏈格孢菌所產(chǎn)生的選擇性毒素對(duì)植物有致病性，對(duì)人體健康也有一定的影響[1]，所以研究鏈格孢菌的生長(zhǎng)特性，探究鏈格孢菌在不同溫度、pH值、光照、碳

2、源和氮源下的菌落長(zhǎng)勢(shì)、直徑、菌絲生長(zhǎng)速率、菌絲干質(zhì)量、產(chǎn)孢量的變化，可以探明鏈格孢菌在不同條件下的生長(zhǎng)趨勢(shì)。?　　1材料與方法?　　試驗(yàn)材料?　　PDA固體培養(yǎng)基：200g馬鈴薯，20g瓊脂，20g葡萄糖，加水補(bǔ)足1000mL。PCA固體培養(yǎng)基：g胰蛋白胨，酵母浸粉，g葡萄糖，20g瓊脂，pH值為7，加水補(bǔ)足1000mL。胡蘿卜固體培養(yǎng)基：將胡蘿卜去皮后稱取200g，20g瓊脂，加水補(bǔ)足1000mL。番茄果肉固體培養(yǎng)基：200g番茄，20g瓊脂，加水補(bǔ)足1000mL。V8果汁固體培養(yǎng)基：罐裝V8果汁200mL，20g瓊脂，加水補(bǔ)足1000mL。查

3、彼固體培養(yǎng)基：gNaNO3，1gK2HPO4，KCl，MgSO4，gFeSO4，30g蔗糖，20g瓊脂，加水補(bǔ)足1000mL。?　　試驗(yàn)方法?　　病原菌的分離?　　根據(jù)方仲達(dá)的方法[2]，對(duì)番茄發(fā)病處病原菌進(jìn)行分離，采用單孢子分離法獲得純化菌株，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)后保存?zhèn)溆?。生物學(xué)特性研究以所獲得的純化菌株tomato為供試菌株。?　　病原菌形態(tài)學(xué)鑒定?　　將供試菌株在PDA培養(yǎng)基上活化，2℃恒溫培養(yǎng)d后，用無(wú)菌水制成一定濃度的孢子懸液，同時(shí)觀察菌落顏色、大小、形狀及分生孢子的形態(tài)和顏色，從而進(jìn)行病原菌的鑒定。?　　生物學(xué)特性的研究?　　溫度對(duì)

4、菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響[3]?　　用打孔器將菌體轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基上，分別置于1、4、15、25、28、30、37、40℃的培養(yǎng)箱內(nèi)，黑暗條件下培養(yǎng)d，用十字交叉法測(cè)量菌落的直徑，采用小室培養(yǎng)法，將孢子懸液滴于凹玻片上，置于以上條件下培養(yǎng)3、6、1h后，分別檢查孢子萌發(fā)率。使用棉藍(lán)乳酚油固定孢子懸液，鏡檢200個(gè)孢子，記下萌發(fā)的孢子數(shù)量，計(jì)算萌發(fā)率。每個(gè)處理3次重復(fù)?！　≈祵?duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響?　　用1mol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH值和孢子懸液的pH值為3～12。分別置于2℃恒溫、黑暗條件下和小室恒溫培養(yǎng)，觀察菌落直徑

5、，計(jì)算孢子萌發(fā)率。?　　光照條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響?　　將接入菌塊的PDA培養(yǎng)基和孢子懸浮液，分別在光—暗周期為1h—1h、完全光照和完全黑暗3種處理?xiàng)l件下，于2℃恒溫培養(yǎng)。觀察菌落直徑，計(jì)算孢子萌發(fā)率。?　　不同培養(yǎng)基對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響?　　分別以PDA、PCA、番茄果肉固體培養(yǎng)基、V8果汁固體培養(yǎng)基和胡蘿卜固體培養(yǎng)基用打孔器將菌體轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基中心位置，置于2℃下恒溫培養(yǎng)d，用十字交叉法測(cè)量菌落的直徑。每個(gè)樣品3次重復(fù)，計(jì)算平均值。?　　不同碳源和氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響[4]?　　選取D-木糖、D-果糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖和

6、麥芽糖等量替換查彼培養(yǎng)基中的碳源，使得各個(gè)不同碳源培養(yǎng)基中碳的含量相同；用不加碳源的培養(yǎng)基作為對(duì)照。?　　選取L-谷氨酸、天冬酰胺、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏等量替換查彼培養(yǎng)基中的氮源，使得各個(gè)不同碳源培養(yǎng)基中氮的含量相同；用不加氮源的培養(yǎng)基作為對(duì)照。?　　將菌塊轉(zhuǎn)接到PDA固體平板中央，放置在2℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3、d后用十字交叉法測(cè)量菌落的直徑，對(duì)照平行組計(jì)算出平均數(shù)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。?　　光照對(duì)菌株生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響?　　將菌塊轉(zhuǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基內(nèi)，分別在光—暗周期為1h—1h、完全光照和完全黑暗3種處理?xiàng)l件下，2℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；

7、3、d后測(cè)量菌落的直徑，對(duì)照平行組計(jì)算出平均數(shù)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。?　　將制備好的孢子懸浮液滴于凹玻片上，分別在光—暗周期為1h—1h、完全光照和完全黑暗3種處理?xiàng)l件下，2聯(lián)盟℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，6、1h后測(cè)定孢子萌發(fā)率。?　　致死溫度的確定?　　吸取1mL孢子懸液至無(wú)菌試管中，分別置于40～6℃的恒溫水浴鍋中處理5～20min后迅速冷卻。將處理后的孢子懸液滴于凹玻片上，2℃小室培養(yǎng)，1h后觀察孢子萌發(fā)情況，測(cè)定孢子萌發(fā)率。2結(jié)果與分析?　　分離菌株的形態(tài)學(xué)觀察?　　分離純化后獲得5株菌株，分別編號(hào)為tomato、tomato、tomato、t

8、omato、tomato，將這些菌株培養(yǎng)d即可長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿，該菌的基本形態(tài)特征為：在PDA培養(yǎng)基上，菌落較為致密，呈絮狀平鋪生長(zhǎng)，菌落