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1、木棉褐斑病病原菌鑒定及生物學(xué)特性 木棉CEibapentandraGaertn.屬木棉科高大落葉喬木，原產(chǎn)于熱帶美洲和東印度群島。目前，廣泛引種于東南亞及非洲熱帶地區(qū)[1]，我國主要分布于廣西、云南、海南、廣東、四川、貴州和福建等地。其樹生長迅速，加之花、根、皮、木材和種子等經(jīng)過不同工藝加工處理后均可利用，兼具經(jīng)濟、藥用和觀賞的價值[2-5]。目前，木棉在生產(chǎn)中不僅是優(yōu)良的林用木材和綠化樹種，而且其蒴果纖維更是優(yōu)良的紡織材料，其纖維與其他天然材料相比，具有不易潮濕、抗壓力強、保暖性好和不蛀不霉變等特性，是一種極具市場前景的新型生態(tài)紡織材料[6]。由
2、于木棉兼具優(yōu)良林用、綠化和紡織等多方面的經(jīng)濟價值，近年來，我國南方地區(qū)種植面積越來越大，尤其海南在綠化寶島和打造木棉之鄉(xiāng)等相關(guān)項目的支持下，目前，整體種植面積已達10000hm2[7]。關(guān)于木棉研究，主要集中于纖維開發(fā)利用和優(yōu)良品種選育2個方面，然而隨著木棉種植面積的逐漸增大，必將導(dǎo)致病蟲害大面積發(fā)生，影響其產(chǎn)量和質(zhì)量，而且國內(nèi)外關(guān)于木棉種植中病蟲害的研究報道甚少。2016年11月在海南省儋州市木棉育苗基地大面積發(fā)生木棉褐斑病，筆者對海南多地的木棉分布區(qū)域進行采樣調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該病害在海南已經(jīng)大面積發(fā)生。為明確木棉褐斑病病原，本試驗通過柯赫氏法則分離純化病
3、原菌后，采用形態(tài)學(xué)描述方法對該致病菌進行了鑒定，并對致病菌進行了生物學(xué)特性初步研究，以期為木棉褐斑病的發(fā)生及綜合防治提供理論依據(jù)。? 1材料與方法? 試驗材料? 供試病樣? 試驗分離所用病樣均采集于海南大學(xué)儋州校區(qū)農(nóng)科教學(xué)實習(xí)基地中發(fā)病的木棉植株。? 供試藥品? 葡萄糖、谷氨酸、KH2PO4、NaOH、甘露醇、NH4NO3、KNO3、KCl、蔗糖、MgSO4、脲、Ca2、NaNO3、鹽酸、Fe23、可溶性淀粉均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；麥芽糖、瓊脂粉、α-乳糖均為生化試劑，國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。? 試驗方法? 木棉褐斑病癥狀
4、描述? 通過基地觀察木棉褐斑病的典型癥狀，記錄其發(fā)病特點，并對典型癥狀進行拍照。? 木棉褐斑病病原分離及致病性測定? 取基地發(fā)病木棉葉片帶回實驗室后，采用常規(guī)組織分離法進行分離[8]。分離時取病健交界處的葉片組織，接種到PDA培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱中2℃培養(yǎng)d，期間取樣進行鏡檢。然后挑取較純菌落，進行純化處理，并對純化后的菌落、菌絲體、病原孢子等進行形態(tài)描述和顯微拍照。根據(jù)柯赫氏法則操作步驟，采用針刺法接種菌餅的方式對溫室盆栽苗進行致病性測定[9]，處理時以接種不帶菌的培養(yǎng)基作為空白對照，觀察記錄，d后對接種發(fā)病葉片再次進行分離病原。? 木棉
5、褐斑病病原鑒定? 將純化病原菌用PDA培養(yǎng)基于2℃下培養(yǎng)產(chǎn)孢后，制作臨時玻片進行顯微觀察。根據(jù)菌落特征，菌絲形態(tài)，分生孢子大小、形態(tài)及顏色等相關(guān)特征。查閱相關(guān)文獻進行比對后，確定病原菌的分類地位[10-15]。? 木棉褐斑病病原菌生物學(xué)特性研究? 不同溫度對菌絲生長的影響在生長良好菌落邊緣，用直徑mm打孔器打取菌絲塊，接種于PDA培養(yǎng)基上，置于5、10、15、20、25、28、30、32、35、40℃10個不同溫度中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)d后用十字交叉法測量個菌落直徑，每個處理重復(fù)5次。? 不同pH值對菌絲生長的影響在無菌條件下，用滅菌的mol/LHC
6、l和mol/LNaOH溶液，將經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)基pH值分別調(diào)節(jié)至、、、、、、、等8個梯度。經(jīng)接種病原菌后，置于2℃中進行培養(yǎng)，d后用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復(fù)5次。? 不同碳源對菌絲生長的影響以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用等量α-乳糖、麥芽糖、葡萄糖、D-甘露糖和可溶性淀粉分別替代Czapek培養(yǎng)基中蔗糖作為碳源，配制不同碳源的培養(yǎng)基。然后接種病原菌于不同碳源的培養(yǎng)基上，2℃培養(yǎng)d后用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復(fù)5次。? 不同氮源對菌絲生長的影響以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用等量的NaNO3、Ca2、谷氨酸、酵母膏、脲和
7、NH4NO3分別替代Czapek培養(yǎng)基中KNO3作為氮源，配制不同氮源的培養(yǎng)基。然后接種病原菌于不同氮源的培養(yǎng)基上，2℃培養(yǎng)d后用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復(fù)5次。? 不同光照條件對菌絲生長的聯(lián)盟影響在PDA培養(yǎng)基上接種純化病原菌后，分別置于全黑暗處理、全光照處理、光暗交替3種光照環(huán)境中2℃培養(yǎng)d后用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復(fù)5次。? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析? 用Excel統(tǒng)計軟件計算菌絲生長抑制率，采用SPSS軟件進行分析各重復(fù)處理間的方差值和不同處理間的顯著性檢驗?！?結(jié)果與分析? 木棉褐斑病危害癥狀? 木棉褐斑病主要危害木棉葉片
8、及莖稈，葉片發(fā)病初期，被侵染葉片首先表現(xiàn)為暗褐色小點，后期病斑逐漸擴大為圓形、梨形甚至橢圓形的
