乙肝寧顆?？挂倚透窝撞《镜捏w外實驗研究

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1、乙肝寧顆粒抗乙型肝炎病毒的體外實驗研究　　摘要：目的探討體外乙肝寧顆?？挂腋尾《净钚?。方法將不同濃度乙肝寧顆粒與HepG⒉⒉15細胞株共培養(yǎng)9d，以拉米夫定為陽性對照藥，以MTT比色法觀察藥物細胞毒性；用ELIS法測定細胞上清液中乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg），乙型肝炎病毒s抗原（HBsAg）；采用熒光定量PCR法（FQ-PCR）測定細胞上清液HBVDNA，計算抑制率。結(jié)果乙肝寧顆粒在體外能有效抑制HepG⒉⒉15細胞分泌HBsAg和HBeAg，最大抑制率分別為54.69%和25.93%；對HBVDNA的復制有一定

2、抑制作用（P<0.05）。結(jié)論乙肝寧顆粒能有效抑制HepG⒉⒉15細胞中HBV復制，說明在體外具有顯著的抗乙型肝炎病毒作用，且毒性較小，具有良好應用前景。　　關鍵詞：乙肝寧顆粒；HepG⒉⒉15細胞；乙型肝炎病毒　　乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（HBV）引起的、以肝臟炎性病變?yōu)橹?，并可引起多器官損害的一種疾病，也是我國當前流行最為廣泛、危害性最嚴重的一種疾病。中醫(yī)藥是我國的特色和寶庫，在治療病毒性肝炎方面發(fā)現(xiàn)了不少有效的單方和復方制劑?！　∫腋螌庮w粒是基于理論研究和臨床觀察，將黃芪、黨參、白花蛇舌草、綿茵陳等13味中藥

3、按君、臣、佐、使進行配伍而制成的復方顆粒劑。具有補氣健脾，活血化瘀，清熱解毒的功效，用于慢性乙型肝炎[1]。文獻報道[2-8]臨床上應用乙肝寧顆粒治療慢性乙肝療效較好。伍一文[9]等對其保肝、降酶、抗鴨乙肝病毒及免疫功能等作用進行了實驗研究。為探討乙肝寧顆?？挂腋尾《咀饔茫疚挠肏epG⒉⒉15細胞株為模型，考察了用藥后細胞培養(yǎng)上清液中乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、E抗原（HBeAg）的改變，并采用熒光定量PCR法考察其對HBVDNA的抑制效果，評價其抗HBV活性?！　?材料　　⒈1試藥HepG⒉⒉15細胞株（

4、購自上海細胞所），乙肝寧顆粒（九芝堂股份有限公司，購于東方大藥房，批號130124），拉米夫定（3TC，葛蘭素史克制藥有限公司，批號13020027），HBeAg診斷試劑盒（批號201304035）和HBsAg診斷試劑盒（批號201307009）（上海華泰生物工程公司）、HBVDNA熒光定量PCR檢測試劑盒（批號20130617）（上?？迫A生物工程股份有限公司）。四甲基偶氮唑鹽（SigmaUSA），MEM培養(yǎng)基粉、丙酮酸鈉、胎牛血清（上海韻涵生物科技有限公司）、G418（Gibco，USA），Trypleexpres

5、s（Invitrogen，USA），　?、?儀器熒光定量PCR儀（ABl7500，ABI，USA），CO2恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisher，USA），-80℃冰箱，酶標儀，倒置顯微鏡（德國Leica公司），生物安全柜（上海振梓創(chuàng)空氣凈化設備有限公司）。　　2方法　?、?細胞模型[10]HepG⒉⒉15細胞株（購自上海細胞所），細胞用MEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，500mg?L-1G418），置37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔3d換液，6d傳代1次。待HBVDNA表達穩(wěn)定后開始實驗?！　?.2乙肝寧顆粒溶液

6、與3TC溶液的配制將乙肝寧顆粒研細，準確稱取乙肝寧顆粒粉末，3TC適量，溶解于無菌雙蒸水中，按每次用量分裝成若干份，保存于-20℃冰箱中，用時取出一份，用含2%胎牛血清，500mg?L-1G418的培養(yǎng)基稀釋制備成質(zhì)量濃度分別為25mg?L-1，50mg?L-1，100mg?L-1，200mg?L-1，400mg?L-1的乙肝寧顆粒溶液，以及質(zhì)量濃度分別為100mg?L-1，10mg?L-1，1mg?L-1，0.1mg?L-1，0.01mg?L-13TC的溶液?！　、?藥物細胞毒性實驗參照Mosmann建立的四甲基偶

7、氮唑鹽法（MTT）[11]，檢測藥物對HepG⒉⒉15細胞生長的抑制作用。具體方法為HepG2.2.15細胞1瓶，用胰酶消化后制備成單細胞懸液，計數(shù)后調(diào)整細胞濃度至3.0×106cells?mL-1。加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL。培養(yǎng)板置于細胞培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO2培養(yǎng)過夜待貼壁。吸去上清后分別加入乙肝寧顆粒供試品溶液和3TC溶液的DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，pH7.2），每孔100皿，每個濃度3復孔。同時設不加藥物的細胞對照組。同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每天收取上清液（-80℃冰箱保存）并更換原濃度新鮮藥

8、液，共加藥培養(yǎng)9d。9d后，采用MTT法，測定570nm的吸光度（A），觀察藥物對細胞的毒性。實驗重復3次，計算細胞存活率，按Reed-Meuench法[12]計算半數(shù)有毒濃度Tc50和最大無毒濃度TC0。TC50即細胞存活率為50%時的藥物濃度；一般認為在藥物作用下若細胞存活率>95%，此藥物濃度即為TC0，對培養(yǎng)細胞無毒性，為藥物作用的安全