白背葉根抗乙型肝炎病毒的體外實驗研究

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1、白背葉根抗乙型肝炎病毒的體外實驗研究作者：張曉剛，呂志平，譚秦湘，鐘小蘭【關(guān)鍵詞】白背葉根；抗乙型肝炎病毒；,,,HepG2.2.15細胞　　摘要：目的觀察白背葉根體外抗乙型肝炎病毒（HBV）的活性。方法以HepG2.2.15細胞株為模型，用微粒酶免疫測定技術(shù)（MEiA）檢測細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg、HBeAg含量，用PCR熒光定量技術(shù)檢測細胞上培養(yǎng)上清液中HBVDNA的變化，以MTT比色法觀察藥物的細胞毒性。結(jié)果白背葉根對HepG2.2.15細胞的TC50為48.25mg/ml，對抑制HepG2.2.15細胞分泌HBsAg和HBeAg

2、的治療指數(shù)分別為13.26和43.08。對HBVDNA僅有微弱抑制作用。結(jié)論白背葉根在體外細胞培養(yǎng)中具有直接抗HBV活性?！　￡P(guān)鍵詞：白背葉根；抗乙型肝炎病毒；HepG2.2.15細胞　　白背葉根為大戟科野桐屬植物白揪的根，在我國分布較廣，資源豐富。異名白膜根、野桐根，味微苦、澀、性平，有清熱、利濕、固脫、消淤等功效。民間常用鮮根水煎服治療急慢性肝炎。動物實驗證實白背葉根具有較好的抗肝纖維化、抗肝炎和抗肝傷作用［1，2］，為進一步了解白背葉根對HBV復(fù)制的影響，我們用HepG2.2.15細胞株為模型，觀察白背葉根體外抗HBV活性，并對其作

3、用機理初步探討?！　?材料與方法　　1.1藥物白背葉根煎煮，水浴蒸發(fā)濃縮為2g/ml，以8層細紗布粗濾后，經(jīng)1500r/min離心10min，上清液再用定性過濾液紙粗濾，25℃下測pH值為5.09，調(diào)節(jié)pH值為7.09，再經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌，置于4℃存放備用。干擾素α1b（賽若金）由深圳科興生物工程股份有限公司提供，10萬IU/支（實驗用藥）?！　?.2細胞培養(yǎng)HepG2.2.15細胞來自南方醫(yī)科大學(xué)（原第一軍醫(yī)大學(xué)）全軍病毒性肝炎重點實驗室。將HepG2.2.15細胞接種于DMEM混合培養(yǎng)液（含20%胎牛血清、0.03%L谷

4、氨酰胺、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、380μg/mlG418），置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。換液1次/3d，6~10d傳代。每次換液留取上清，檢測HBVDNA分泌情況，表達穩(wěn)定后開始實驗?！　?.3藥物對HepG2.2.15細胞的毒性實驗根據(jù)SargentJM等［3］建立的MTT比色分析法，判定各孔中存活細胞增殖代謝情況及細胞毒性反應(yīng)。將白背葉根提取液用DMEM混合培養(yǎng)液分別稀釋成1000，500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.82，3.91，1.96mg/ml和1000，500，

5、250，125，62.5，31.25，15.63，7.82，3.91，1.96μg/ml等20個實驗濃度，培養(yǎng)細胞用胰蛋白酶消化，配制成濃度為10×104/ml的細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.1ml，37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)，于48h后換入不同濃度含藥DMEM混合培養(yǎng)液，同時設(shè)無藥物細胞對照組，每濃度4孔，每4天換新鮮含藥培養(yǎng)液，共2次。第8天每孔加入MTT溶液（1mg/ml）200μl，繼續(xù)在37℃下孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清，然后每孔加入150μlDMSO，震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，置入酶聯(lián)檢測儀中

6、以570nm波長測定各孔光吸收值（OD值），重復(fù)3次，依照ReedMuench法［4］計算藥物對HepG2.2.15細胞的抑制百分率（%）=（細胞對照組平均A組-實驗組平均A值）/細胞對照組平均A值×100%；細胞半數(shù)有毒濃度（TC50）=Antilg［lgB+(50-B)的抑制百分率/（A-B）的抑制百分率）×C］×100%，治療指數(shù)（TI）=半數(shù)有毒濃度（TC50）/半數(shù)有效濃度（IC50）。TI＞2為有效低毒，1＜TI＞2為低效低毒，TI＜2為毒性作用。注：A=lg＞50%藥物濃度，B=lg＜50%藥物濃度，C=lg稀釋倍數(shù)。　　1

7、.4藥物應(yīng)用培養(yǎng)細胞用胰島蛋白酶化，配制成濃度為10×104/ml的細胞懸液接種于24孔培養(yǎng)孔，每孔1ml，37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)，根據(jù)藥物毒性度驗結(jié)果，于48h后換入6種不同濃度（31.25，15.63，7.82，3.91，1.96，0.98mg/ml）的細胞全培養(yǎng)液，陽性對照藥物為干擾素α1b（賽若金100，200，400IU），同時設(shè)不含藥物的細胞對照組。每4天換新鮮含藥培養(yǎng)液，共2次，于第4，8天留取培養(yǎng)液作為檢測標本-20℃保存，同批次試劑同一時間檢測?！　?.5上清液中HBsAg，HBeAg的檢測采用微粒酶免疫（ME

8、IA）測定技術(shù)（美國Abbott公司AXSYM全自動免疫分析系統(tǒng)及試劑盒）檢測，結(jié)果以S/CO值表示。抑制率=（細胞對照組S/CO值-藥物組S/CO值）/細胞對照組/S/CO值×100%。