資源描述：
《clock基因?qū)π坌孕∈笊彻δ苡绊憽酚蓵?huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、Clock基因?qū)π坌孕∈笊彻δ苡绊懽髡撸汉戊映涉昧忽蝿⒀佑淹粲钶x江舟王正榮【摘要】目的：通過(guò)干擾小鼠睪丸精子節(jié)律基因Clock的表達(dá)，研究Clock對(duì)雄性小鼠生殖能力的影響。方法：通過(guò)RNAi技術(shù)，向小鼠睪丸注射Clock干擾質(zhì)粒干擾雄性小鼠睪丸節(jié)律基因Clock的表達(dá)。研究干擾Clock基因后精子數(shù)量、精子活力、體外受精率和雌鼠胎仔數(shù)變化，以及對(duì)精子頂體內(nèi)透明質(zhì)酸酶活性、芳香基硫酸酯酶A的含量影響。結(jié)果：Clock干擾質(zhì)粒在體內(nèi)可影響雄性小鼠的胎仔數(shù)，但注射干擾質(zhì)粒后小鼠精子計(jì)數(shù)、精子活力及體外授精率無(wú)明顯變化，精子頂體內(nèi)透明質(zhì)酸酶活性和芳香基硫酸酯酶A含量也
2、無(wú)明顯變化。結(jié)論：節(jié)律基因Clock與雄性小鼠生殖能力有密切關(guān)系?！娟P(guān)鍵詞】Clock基因;RNA干擾;圓形精子;頂體9自然界中，近日節(jié)律基因廣泛存在于生物體內(nèi)，調(diào)控著機(jī)體的生命活動(dòng)。在所有生物體內(nèi)存在類(lèi)似的包括Clock、Period等節(jié)律基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控所形成的分子振蕩。其中Clock作為近日節(jié)律的核心基因，其表達(dá)的蛋白Clock與Bmal1形成異二聚體，在近日節(jié)律分子振蕩中發(fā)揮著重要作用。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，小鼠生精過(guò)程中圓形精子的頂體具有明顯的Clock的表達(dá)[1]。而在睪丸中，Clock表達(dá)的圓形精子期是小鼠生精周期中頂體發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期[2]，利用RNA干
3、擾(RNAi)技術(shù)，干擾Clock小鼠睪丸中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)雄鼠睪丸Clock蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，頂體酶活性明顯下降，生殖功能明顯下降[3]，提示節(jié)律基因Clock可能與精子的受精能力有關(guān)。本文利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，干擾Clock在小鼠睪丸中的表達(dá)，進(jìn)一步探討Clock基因?qū)π∈笊彻δ苡绊懙臋C(jī)制?！ ?材料與方法 1.1材料 1.1.1動(dòng)物SPF級(jí)ICR小鼠，雄鼠6～8w，雌鼠4～6w，由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在12L∶12D光暗循環(huán)下自由飲食，雌雄分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)小鼠籠具?！ ?.1.2主要試劑Clock干擾質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒(由本實(shí)驗(yàn)室
4、提供)，小鼠芳基硫酸酯酶A(ASA)ELISA檢測(cè)試劑盒(Unionhonest公司生產(chǎn))，其余試劑均由實(shí)驗(yàn)室提供。 1.2方法 1.2.1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(胎仔數(shù))920只雄鼠隨機(jī)分為干擾組(RNAi)和對(duì)照組(Control)，每組10只。乙醚麻醉，固定雙側(cè)睪丸，分別用微量注射器將干擾質(zhì)粒(干擾組)和空質(zhì)粒(對(duì)照組)于雙側(cè)睪丸各注射20μl。注射后16d的13∶00-14∶00對(duì)雌鼠進(jìn)行腹腔注射PMSG(孕馬血清促性脈激素)，46-48h后腹腔注射hCG。雌鼠注射HCG(人絨毛膜促性脈激素)后的當(dāng)天將兩組雄鼠按雌雄2∶1的比例合籠。雌鼠受孕后立即處死雄鼠，測(cè)定精子數(shù)
5、量以及精子活力。合籠后受孕的雌鼠大約在21d開(kāi)始產(chǎn)仔，分別計(jì)數(shù)每只雌鼠的胎仔數(shù)?！ ?.2.1.1精子計(jì)數(shù)雄鼠處死后，立即剪開(kāi)附睪尾，放置于盛有1.5mlT6(人脈巴細(xì)胞亞群分樣)+15mg·ml-1BSA(牛血清白蛋白)培養(yǎng)基的表面皿中，37℃、5%CO2孵箱預(yù)平衡過(guò)夜。隨后將附睪尾剪成四段，在37℃、5%CO2孵箱中孵育30min，讓精子充分游出，立即計(jì)數(shù)精子數(shù)量?！ ?.2.1.2精子活力精子從附睪尾釋放出來(lái)2～4h內(nèi)，在高倍鏡下觀察5～10個(gè)視野，計(jì)數(shù)100個(gè)精子并進(jìn)行分級(jí)。精子活力分為4級(jí)，快速前向運(yùn)動(dòng)為+++、慢而呆滯的前向運(yùn)動(dòng)為++、非前向運(yùn)動(dòng)為+、原
6、地不動(dòng)為-?！ ?.2.2體外受精(IVF)取20只4～6w雌鼠，以48h間隔腹腔注射PMSG10IU和hCG10IU誘發(fā)超排卵，注射hCG后15～16h處死小鼠，立即開(kāi)腹取出輸卵管，放進(jìn)0.5mlT6+20mg·ml-19BSA培養(yǎng)皿內(nèi)，在解剖鏡下用解剖針?biāo)洪_(kāi)膨大的壺腹部，將卵丘細(xì)胞包圍的合子團(tuán)釋放出來(lái)。將合子在透明質(zhì)酸酶溶液中放置到卵丘細(xì)胞脫掉為止。用移卵管將合子收集并轉(zhuǎn)移到含新鮮的M2培養(yǎng)液中，洗幾次以去除殘留的透明質(zhì)酸酶、卵丘細(xì)胞以及雜質(zhì)。然后將合子轉(zhuǎn)移到微滴培養(yǎng)皿中，用平衡好的培養(yǎng)液洗滌3次后，轉(zhuǎn)入事先在37℃、5%CO2孵箱預(yù)平衡過(guò)夜T6+20mg·ml
7、-1BSA受精滴中，并準(zhǔn)確計(jì)數(shù)加入到每個(gè)受精滴中卵細(xì)胞數(shù)。把4～10μl孵育過(guò)的干擾組和對(duì)照組的小鼠精子懸浮液分別加入到含有卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的受精滴中，精子濃度為1×106·ml-1左右。將培養(yǎng)皿中加入精、卵細(xì)胞的受精滴放回37℃、5%CO2孵箱保持孵育5～6h。用200倍倒置顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)兩組20個(gè)受精滴中的二細(xì)胞數(shù)量，即受精卵的數(shù)量，評(píng)價(jià)精子的體外受精率?！ ?.2.3Clock干擾質(zhì)粒對(duì)頂體內(nèi)的酶的影響 1.2.3.1透明質(zhì)酸酶活性檢測(cè)[4] 在同時(shí)注射干擾質(zhì)粒和空質(zhì)粒18d后，分別處死兩組小鼠，摘除附睪尾，在PBS中去除附著在附睪上的脂肪，立即放
