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《crbp-1基因rnai慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、CRBP-1基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定作者：陳波，李建平，戴途，吳志勇，羅蒙，孫勇偉【摘要】目的：構(gòu)建大鼠視黃醇結(jié)合蛋白-1(cellularretinol-bindingprotein-I，CRBP-1)基因RNAi（RNAinterference，RNAi）慢病毒載體。方法：針對已經(jīng)篩選確定的大鼠CRBP-1基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成雙鏈DNA，與經(jīng)HpaI和XhoI酶切后的pGCL-GFP載體連接產(chǎn)生短發(fā)卡RNA慢病毒載體，PCR篩選陽性克隆，測序鑒定。結(jié)果：PCR鑒定與DNA測序證實合成的含CRBP-1shRNA慢病毒載體寡核苷酸鏈插入正
2、確。結(jié)論：成功構(gòu)建大鼠CRBP-1基因RNAi慢病毒載體。【關鍵詞】RNA干擾；視黃醇結(jié)合蛋白-1；慢病毒[Abstract]Objective：ToconstructalentiviralvectorofRNAinterference（RNAi）ofratcellularretinol-bindingproteinI(CRBP-I)gene.Methods：TheeffectivesequenceofsiRNAtargetingCRBP-Igenewasconfirmedinourpreviousstudy.ThecomplementaryDNAcontainingbothsensean
3、dantisenseOligoDNAofthetargetingsequencewasdesigned，synthesizedandclonedintothepGCL-GFPvector，toconstructalentiviralvector8whichexpressedshorthairpinRNA(shRNA)，anditwasidentifiedbyPCRandDNAsequencing.Results：PCRidentificationandDNAsequencingdemonstratedthatinsertionofoligonucleotideofthelentivirus
4、RNAivectorcontainingCRBP-IshRNAwasright.Conclusion：ThelentivirusRNAivectorofratCRBP-Iwasconstructedsuccessfully.[Keywords]RNAinterference；Cellularretinol-bindingproteinI；Lentivirus肝星狀細胞（hepaticstellatecells，HSC）的激活過程是肝臟膠原產(chǎn)生和肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)[1]，在肝纖維化逆轉(zhuǎn)過程中也起重要作用，2002年UchioK[2]在用CCl4制備大鼠肝纖維化模型中發(fā)現(xiàn)，活化第5天的HS
5、C中CRBP-1表達明顯增加，而視黃醇脂滴消失，提示CRBP-1與肌成纖維樣細胞的形成密切相關。近年來，隨著RNAi技術(shù)的出現(xiàn)，為研究內(nèi)源性基因功能和信號轉(zhuǎn)導途徑提供了強有力的研究工具。我們在已經(jīng)獲取CRBP-1基因的RNAi有效靶序列的基礎上，設計、構(gòu)建和鑒定表達CRBP-1shRNA的慢病毒載體，為后期研究CRBP-1基因在HSC活化中的作用機制和肝纖維化的基因治療打下基礎。1材料和方法81.1材料PCR用試劑primer、dsDNAOligo（上海吉凱基因技術(shù)有限公司合成），大腸桿菌菌株DH5α，DMEM，胎牛血清、胰蛋白酶（Invitrogen公司）。慢病毒載體系統(tǒng)（Tronola
6、b公司www.tronolab.com/lentivectors.php）.該病毒包裝系統(tǒng)由pGCL-GFP載體，pHelper1.0(gag/pol元件)載體，Helper2.0(VSVG元件)載體三質(zhì)粒組成，其中pGCL-GFP載體含有能持續(xù)表達小RNA的元件，同時能表達熒光蛋白marker(GFP/RFP)，pHelper1.0和pHelper2.0含有病毒包裝所必須的元件。限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶（NewEnglandBiolabs公司）。1.2方法1.2.1雙鏈DNAOligo制備用Ambion公司的設計軟件，設計、合成3對針對CRBP-1基因shRNA的寡核苷酸序列，經(jīng)分
7、別構(gòu)建質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293細胞，據(jù)其對CRBP-1的抑制率，確定有效靶序列：Pscsi-1:CCGCAAGTGCATGACCACA，（CRBP-1mRNANM_012733，GenBankGI:77416367）.設計并合成其shRNA的DNAOligo：Pscsi495-1：5'-CCGGGACC-CAAGTGCATGACCACACTCGAGTGTGGTCATGCA-8CTTGCGGTCTTTTTG-3'，Pscsi495
