smad4基因rnai慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定論文

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1、Smad4基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定論文季國忠,張發(fā)明,翟惠虹,范志寧,樊代明,王學浩【關(guān)鍵詞】慢病毒ConstructionandidentificationoflentiviralvectorofRNAinterferenceofSmad4gene【Abstract】AIM:ToconstructalentiviralvectorofRNAinterference(RNAi)ofSmad4gene.METHODS:TheeffectivesequenceofsiRNAtargetingSmad4geneedinourpreviousstudy.TheplementaryDNAc

2、ontainingbothsenseandantisenseOligoDNAofthetargetingsequenceoterandgreenfluorescentprotein(GFP).TheresultinglentiviralvectorcontainingSmad4shRNAedLVshSmad4,anditedbyPCRandsequencing.293Tcellsad4,pCMVdR8.74andpMD2G.Allvirusstocksphosphatemediatedtransfection.Thetiterofvirusonstratedthatthelentiviru

3、sRNAivectorofSmad4(LVshSmad4)producingSmad4shRNAad4ad4;Neoplasms;Lentivirus【摘要】目的:構(gòu)建Smad4基因RNAi慢病毒載體.方法:針對已經(jīng)篩選確定的Smad4基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的OligoDNAlentivectors.php).該病毒包裝系統(tǒng)由pLVTHM,pCMVdR8.74和pMD2G3質(zhì)粒組成,其中pLVTHM含有能持續(xù)表達小RNA的元件,同時能表達綠色熒光蛋白(GFP).pCMVdR8.74和pMD2G含有病毒包裝所必須的元件.限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、大量質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Q

4、iagen公司).1.2方法1.2.1構(gòu)建表達shRNA慢病毒載體用Ambion公司的設(shè)計軟件,設(shè)計、合成3對針對Smad4基因shRNA的寡核苷酸序列.經(jīng)分別構(gòu)建質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染293細胞,據(jù)其對Smad4的抑制率,確定有效靶序列:5′GTACTTCATACCATGCCGA3′,(Smad4mRNA第1848位,GenBankgi:34147555).設(shè)計并合成(上海吉凱基因化學技術(shù)公司)其shRNA的DNAOligo:5′CGCGTCCCCGTACTTCATACCATGCCGATTCAAGAGATCGGCATGGTATGAAGTACTTTTTGGAAAT3′(內(nèi)含MluI和ClaI酶切位點,

5、下劃線所示.tronolab.lentivectors.php).經(jīng)退火形成雙鏈DNA,與經(jīng)MluI和ClaI雙酶切后的pLVTHM載體連接,轉(zhuǎn)化DH5大腸桿菌,挑取重組陽性克隆行PCR及測序鑒定(上海博亞生物技術(shù)有限公司).PCR鑒定陽性克隆的primer:Up:5′GTGTCACTAGGCGGGAACAC3′;DoL的細胞培養(yǎng)皿,37℃,50mL/LCO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),細胞密度達60%~70%時轉(zhuǎn)染.制備慢病毒包裝系統(tǒng)中3種質(zhì)粒DNA溶液(LVshSmad420μg,pCMVdR8.7415μg,pMD2G7.5μg),無菌水定容至1800μL,再加入CaCl2(2.5mol/L)溶液

6、200μL,混勻,加入2×BBS緩沖鹽溶液2000μL,室溫放置20~30min.將DNA磷酸鈣混合液轉(zhuǎn)移至含單層細胞的培養(yǎng)液中,混勻,培養(yǎng)12h后棄去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)液,加入PBS15mL,輕搖后棄去,重復該步驟3次.然后每瓶細胞中加入含100mL/L小牛血清的細胞培養(yǎng)液15mL,繼續(xù)培養(yǎng)48h.收集轉(zhuǎn)染72h的293T細胞上清液.于4℃,4000g離心10min;以0.45μm濾器過濾后置于40mL超速離心管中,4℃,25000r/min離心20min;而后以冰PBS液重旋病毒沉淀,于4℃溶解過夜.次日,以10μL每管分裝病毒液置于-70℃冰箱中保存.DMEM培養(yǎng)液重懸293T細胞

7、至5×108/L,在96孔板每孔中加100μL重懸細胞.取6個eppendorf管,每管中加入90μL預熱的OptiMEM培養(yǎng)基,加10μL病毒顆粒于第1管,混勻,從第1管取10μL混合液于下一管,混勻;依次稀釋病毒顆粒至第6管;將96孔板中培養(yǎng)基吸出,每孔加45μL病毒顆粒稀釋液,37℃溫育8h后,更換含100mL/LFBS的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng).倒置熒光顯微鏡下檢測GFP表達量,計算病毒滴度.2結(jié)果2.1陽性克隆的PCR鑒

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