《乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒( 型)核酸檢測試劑盒(pcr-熒光法)操作規(guī)程》

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1、《乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒(1+2型)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光法)操作規(guī)程》蘇州華益美核酸實驗室文件編號：HYM/C-525-JY版本號：1/A實施時間：2012年04月01日乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒（1+2型）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光法）操作規(guī)程1.目的規(guī)范核酸檢測試驗操作，確保檢測結(jié)果的準確性。2.原理2.1匯集：吸取8份（或以下）樣品到指定的匯集管。2.2提?。翰《竞怂崽崛〉姆椒榇胖榉āＴ噭┖刑峁┲畠?nèi)對照(IC)為不具感染性的假病毒，在進行樣品核酸提取前加入樣品中，監(jiān)控提取、擴增和分析的全過程。標本經(jīng)裂解液

2、處理后會將病毒外鞘膜破壞，蛋白質(zhì)變形，使病毒裂解釋放出病毒基因組核酸。加入表面包被有二氧化硅的磁珠顆粒，在高鹽環(huán)境下帶負電荷的核酸吸附到帶正電荷的的磁珠顆粒表面。洗液可以洗去未結(jié)合的物質(zhì)，如變性的蛋白、細胞碎片、PCR抑制物等并降低鹽濃度。純化的病毒在特定的環(huán)境下從磁珠顆粒表面洗脫下來成為擴增的模板。2.3擴增：采用PCR擴增TaqMan熒光探針標定技術(shù)同時對HBV（DNA）、HCV（RNA）、HIV（RNA）進行檢測。在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下HCVRNA、HIVRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再與HBVDNA一同通過TaqDNA聚合酶的作用擴增病毒核酸的保守區(qū)域，TaqDN

3、A聚合酶5`—3`外切酶活性切割反應系統(tǒng)中帶熒光標記的TaqMan探針，隨著PCR的進行，熒光信號不斷積累。通過PCR儀的檢測血液標本達到和超過熒光閾值的信號給出樣品的陰陽性結(jié)果。蘇州華益美核酸實驗室文件編號：HYM/C-525-JY版本號：1/A實施時間：2012年04月01日選擇性PCR擴增：采用UNG-dUTP抗污染系統(tǒng)。在PCR擴增系統(tǒng)中采用UTP代替TTP，產(chǎn)生大量U-DNA片段。UNG酶特異識別U-DNA片段中含UTP的位點并進行切割，U-DNA被降解后不能作為再次擴增的模板，系統(tǒng)選擇性的擴增天然的核酸分子，從而防止了PCR擴增產(chǎn)物的污染。2.4質(zhì)量

4、控制原理為監(jiān)控實驗進行，保證實驗結(jié)果的準確，在每次檢測過程依靠陽性、陰性質(zhì)控品以及內(nèi)標進行監(jiān)測。2.4.1陰性質(zhì)控品監(jiān)控系統(tǒng)性假陽性，如果陰性質(zhì)控品檢測結(jié)果為陽性，說明實驗存在假陽性的風險，因此實驗中的陽性結(jié)果需復查。2.4.2低濃度陽性質(zhì)控品監(jiān)控系統(tǒng)假陰性，如果低濃度陽性質(zhì)控品檢測結(jié)果為陰性，說明實驗存在假陰性或靈敏度下降的風險，因此實驗中的陰性結(jié)果均需復測。2.4.3內(nèi)對照分為DNA內(nèi)對照和RNA內(nèi)對照，是每個反應管中的陽性質(zhì)控，用于監(jiān)控單個反應管中DNA與RNA的假陰性風險，如果標本檢測結(jié)果為陰性，其DNA內(nèi)對照與RNA內(nèi)對照結(jié)果必須為陽性，否則提示該標本

5、的擴增受到抑制，該陰性檢測結(jié)果有假陰性風險，需要復測。3.適用范圍適用于核酸實驗室采用核酸技術(shù)進行的HBV、HCV、HIV三項單管混樣檢測。4.職責4.1授權(quán)的檢驗人員負責試驗操作、結(jié)果判讀，作好相關(guān)記錄，對檢測結(jié)果的真實性和有效性負責。4.2授權(quán)的監(jiān)督人員負責監(jiān)督該規(guī)程執(zhí)行。5.原始樣品系統(tǒng)血漿6.材料與設備6.1消耗品6.1.1乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒（1+2型）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光法），蘇州華益美生物科技有限公司；6.1.296孔深孔板6.1.31.5ml離心管（手工實驗用）和2mlAxgen離心管（用于配置PCR反應液）；6.

6、1.45ml匯集管；6.1.596孔擴增板或八連管；6.1.6帶濾芯并經(jīng)滅菌處理的Tip頭；6.1.7自封袋；6.1.8磁棒套管；6.1.9留樣板和封膜蘇州華益美核酸實驗室文件編號：HYM/C-525-JY版本號：1/A實施時間：2012年04月01日6.2.1HAMILTONSTAR全自動樣品處理系統(tǒng)；6.2.2MeDiProSuperPureSystem-32核酸萃取儀；6.2.3ABI7500熒光定量PCR儀；7.檢測環(huán)境7.1符合二級生物安全實驗室條件。工作環(huán)境要求空氣流通、照明充足；室內(nèi)環(huán)境整潔、干凈并配有消毒設備。7.2實驗室溫度：20-30℃；濕度

7、40-60%。8.程序步驟8.1試劑準備區(qū)操作8.1.1消耗品的準備和深孔板反應盤的預分裝8.1.1.1常規(guī)實驗清點當日試驗所需的消耗品，移送標本制備區(qū)，并做好記錄。8.1.1.2手工實驗8.1.1.2.1預分裝洗滌液A、洗滌液B、洗脫液，需充分混勻，使用移液器分配至反應盤L-28.1.1.2.2可于前一工作日預分裝4.2ml核酸萃取液到5ml管；8.1.2反應液的配制8.1.2.1常規(guī)操作8.1.2.1.1從-20℃冰箱取出試劑的反應液A、反應液B、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA保護劑、Taq酶；室溫溶解、平衡（反應液的配制時間應控制在15—20分鐘，則平衡時間大約10分鐘

8、），于震蕩器上充分混勻。