清除自由基研究方法匯總

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1、電子自旋共振法（ESR）、高效液相色譜法、化學(xué)發(fā)光法、比色法、分光光度法自由基清除劑也稱為抗氧化劑，可清除體內(nèi)多余的自由基，減輕它們對機(jī)體的損傷。目前常用超氧陰離子自由基體系（O2-·）、羥基自由基體系（·OH）、二苯代苦味?；杂苫w系（DPPH·）對某抗氧化劑的體外清除自由基能力進(jìn)行了研究。其中ESR法和氣相色譜法、HPLC法對自由基的檢測靈敏度高，但對設(shè)備要求較高，操作復(fù)雜，無法在一般實驗室普及。而其中的分光光度法、化學(xué)發(fā)光法、熒光分析法等不需要昂貴的儀器，易于被一般實驗室所采用，但測定過程中的干擾因素較多，容易對測定的準(zhǔn)確性和靈

2、敏度造成影響。分光光度法最常用。原理部分：1.DPPH·法測試機(jī)理DPPH·（二苯代苦味臍基自由基）的甲醇溶液呈深紫色，可見光區(qū)最大吸收峰為492nm。當(dāng)自由基清除劑加入到DPPH·溶液中時，DPPH·的單電子被配對而使其顏色變淺，在最大吸收波長處的吸光度減少，而且顏色變淺的程度與配電子數(shù)成化學(xué)計量關(guān)系，因此，可通過吸光度減弱的程度來評價自由基被消除的情況。2.羥基自由基（·OH）1）鄰二氮菲法[70]實驗原理：鄰二氮菲可與Fe2+形成絡(luò)合物，此絡(luò)合物在510nm處有最大吸收峰，是一常用的氧化還原指示劑，其顏色變化可敏銳地反映溶液氧化還

3、原狀態(tài)的改變。H2O2/Fe2+體系可通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，鄰二氮菲－Fe2+水溶液被羥自由基氧化為鄰二氮菲－Fe3+后，其510nm最大吸收峰消失。如果反應(yīng)體系中同時存在羥自由基清除劑，則Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基將被此清除劑全部或部分清除，鄰二氮菲－Fe2+絡(luò)合物受到的破壞將會隨之減少。根據(jù)這一原理，可建立以A510變化反映自由基清除劑對羥自由基清除作用的比色測定法。2）水楊酸法[71]實驗原理：羥自由基易攻擊芳環(huán)化合物產(chǎn)生羥基化合物，因此可用水楊酸捕集Fenton反應(yīng)體系中的·OH，生成的2,3－二羥基苯甲酸用乙醚

4、萃取，用鎢酸鈉和亞硝酸鈉顯色，然后用分光光度計測定其在510nm處的吸光值，此吸光值可反映體系中的羥自由基濃度。3）甲基紫-Fe2+-H2O2反應(yīng)體系測定原理：在Fenton反應(yīng)的基礎(chǔ)上加入甲基紫作顯色劑，反應(yīng)式如下：Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH甲基紫在酸性溶液中呈現(xiàn)紫色[9],在578nm處有強(qiáng)吸收。反應(yīng)產(chǎn)生的·OH具有高的反應(yīng)活性，容易進(jìn)攻高電子云密度點，會與甲基紫中具有高電子云密度的-C=C-基團(tuán)發(fā)生親電加成反應(yīng)，使甲基紫褪色。通過測定甲基紫在578nm處吸光度值的變化可間接測定出·OH的生成量。當(dāng)有清除自由基的物

5、質(zhì)存在時，會阻斷甲基紫與·OH的反應(yīng)，從而使得甲基紫的顏色有所加重，因此可利用抗氧化劑加入前后溶液吸光度值的變化來評價物質(zhì)的抗氧化性強(qiáng)弱。3.超氧陰離子自由基（O2-·）鄰苯三酚法：超氧自由基難于用一般方法產(chǎn)生和檢測,但是在弱堿性條件下,鄰苯三酚能發(fā)生自氧化反應(yīng),生成O2-·和有色中間產(chǎn)物,該中間產(chǎn)物在λ=320nm處有一特征吸收峰。在初始階段,中間產(chǎn)物的量與時間成線性關(guān)系。當(dāng)加入O2-·清除劑時,它能迅速與O2-·反應(yīng),從而阻止中間產(chǎn)物的積累,致使溶液在λ=320nm處吸收減弱。故可以通過測定A320值來評價清除劑對O2-·的清除作用

6、。1.黃儒強(qiáng)，李娘輝，黃科禮，鄭陸威，林盛，林健華.(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510631)山稔子黃酮類提取物抗自由基作用及體內(nèi)抗氧化功能的研究[J].食品科學(xué)，2008,29（9）：588-590.1.3.2動物試驗方法選用雄性昆明種小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為正常對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。低、中、高劑量組小鼠每天灌胃1次，每次0.5ml。對試驗小鼠重新進(jìn)行分組，分為高劑量組、中劑量組、低劑量組和對照組。各組均常規(guī)飼養(yǎng)，自然光照，自由飲水。除對照組外，其他各組進(jìn)行如下處理：每天給藥1次

7、，每次每只灌胃0.5ml。1.3.3動物實驗指標(biāo)測定及統(tǒng)計分析連續(xù)試驗3周，最后一次給藥后，禁食2h，摘取各小鼠眼球取血，離心分離，吸取上層血清，用于SOD、GSH-Px、MDA的測定。以對照組為對照，對各試驗組數(shù)據(jù)用SPSS11.0作單因素方差分析和均數(shù)間多重比較。1.3.4清除羥自由基[7]取6支10ml比色管，分別依次加入0.3ml7.5mmol/L硫酸亞鐵銨溶液、0.3ml7.5mmol/L鄰二氮菲溶液、1mlpH7.47Tris-HCl緩沖溶液，在2、3、4、5、6號比色管中各加入0.2ml7.5mmol/LH2O2，然后在3

8、、4、5、6號比色管中分別加入0.3ml濃度分別為0.02、0.04、0.08、0.10mg/ml的山稔子黃酮類提取物，用重蒸水定容至刻度，在37℃的水浴中，反應(yīng)1h，在450～550nm波長范圍內(nèi)掃描，得