塞來(lái)昔布對(duì)人淋巴瘤細(xì)胞株raji增殖、凋亡及存活素表達(dá)的影響

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1、塞來(lái)昔布對(duì)人淋巴瘤細(xì)胞株Raji增殖、凋亡及存活素表達(dá)的影響作者：范紅程遠(yuǎn)東孫哲呂曉東【摘要】目的觀察選擇性COX2抑制劑塞米昔布(Celecoxib)對(duì)Raji細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期分布的影響，并檢測(cè)存活素(Survivin)在細(xì)胞中的表達(dá)情況。方法應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析Celecoxib對(duì)人Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞周期的影響并檢測(cè)細(xì)胞凋亡及存活素在細(xì)胞中的表達(dá)情況，應(yīng)用RTPCR法檢測(cè)細(xì)胞中SurvivinmRNA的表達(dá)水平。結(jié)果Celecoxib各濃度組作用于Raji細(xì)胞24、48、72h后吸光度值與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P<0.05)，同時(shí)各濃度組

2、之間以及時(shí)間組之間有顯著性差異(P<0.05)。Celecoxib各濃度組作用于Raji細(xì)胞48h后各濃度組間Celecoxib對(duì)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的影響、下調(diào)Survivin蛋白表達(dá)下調(diào)SurvivinmRNA相對(duì)表達(dá)量具有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論Celecoxib能夠通過(guò)誘導(dǎo)凋亡抑制Raji細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與抑制Survivin表達(dá)有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】Celecoxib;淋巴瘤;細(xì)胞周期;凋亡;Survivin　選擇性COX2抑制劑塞來(lái)昔布(Celecoxib)是近年來(lái)用于臨床的新型非甾體類抗炎藥，其藥理作用特點(diǎn)是選擇性作用于COX102，能使許多腫瘤細(xì)

3、胞的增殖受到抑制，但具體機(jī)制仍未完全清楚。Survivin作為一種多腫瘤抑制基因在腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程中起調(diào)控作用。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)Survivin表達(dá)與Celecoxib誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡之間關(guān)系的研究尚處于空白。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)人Burkitt′s淋巴瘤Raji細(xì)胞，觀察選擇性COX2抑制劑Celecoxib對(duì)Raji細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、凋亡及細(xì)胞周期分布的影響，并檢測(cè)凋亡抑制因子Survivin在細(xì)胞中的表達(dá)情況?！　?材料與方法　　1.1材料Burkitt′s淋巴瘤細(xì)胞株Raji由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供，常規(guī)培養(yǎng)于含10%的滅活胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37

4、℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3d傳代1次。臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞拒染率均在95%以上。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組:細(xì)胞培養(yǎng)基中加入與實(shí)驗(yàn)組等體積的DMSO。(預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示終濃度0.1%的DMSO在實(shí)驗(yàn)中對(duì)Raji細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響);實(shí)驗(yàn)組:細(xì)胞培養(yǎng)基中加入DMSO溶解的Celecoxib(南京德寶生化器材有限公司)，終濃度分別為12.5、50、100、150μmol/L〔1〕?！　?.2MTT法檢測(cè)Celecoxib對(duì)Raji細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×105/ml,接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl(1×10104個(gè)細(xì)胞/孔)，分別加入處理

5、因素，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞孵育24、48、72h,孵育結(jié)束前4h，各培養(yǎng)孔加入MTT(Merke公司)(5mg/ml)10μl,1500r/min離心10min,棄上清，每孔加入DMSO100μl。震蕩15min溶解結(jié)晶，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)出每孔吸光度值(A492值)，計(jì)算細(xì)胞抑制率?！　?.3流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和周期分布取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/ml,接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1ml(1×106個(gè)細(xì)胞吼)，分別加入處理因素，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞孵育48h后離心收集細(xì)胞，并用70%乙

6、醇固定，4℃過(guò)夜后再經(jīng)PBS洗2次，加入碘化丙啶(PI)1ml,4℃避光30min，用BeckmanCoulter公司提供的流式細(xì)胞儀標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行分析?！　?.4FCM檢測(cè)Raji細(xì)胞中Survivin蛋白表達(dá)收集細(xì)胞，去除樣品中的70%乙醇，用PBS離心洗滌2次，加入Survivin鼠抗人單克隆抗體一抗(Santa公司)工作液100μl,工作濃度1∶100(克隆系FL142)。室溫孵育30min，PBS10ml洗滌1次，棄上清。加入羊抗鼠FITCIgG二抗工作液100μl,室溫孵育30min，PBS10ml離心同上，棄上清，加入PBS0.1ml經(jīng)500目銅網(wǎng)過(guò)濾后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)

7、。10　　1.5RTPCR法檢測(cè)Raji細(xì)胞中Survivin基因表達(dá)水平　　1.5.1細(xì)胞總RNA提取:Trizol試劑盒提取RNA?！　?.5.2RTPCR(1)引物設(shè)計(jì):Survivin、βactin引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。Survivin:上游引物5′GCATGGGTGCCCCGACGTG3′，下游引物5′GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為447bp;βactin:上游引物5