塞來昔布對hl-60細胞增殖、凋亡的影響及其機制研究

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1、河北醫(yī)科大學碩士學位論文塞來昔布對HL--60細胞增殖、凋亡的影響及其機制研究姓名：謝霞申請學位級別：碩士專業(yè)：內(nèi)科學指導教師：郝洪嶺201203中文摘要塞來昔布對HL-60細胞增殖、凋亡的影響及其機制研究摘要目的：急性白血病是造血系統(tǒng)常見惡性腫瘤，目前急性白血病的確切發(fā)病機制尚不明確，臨床治療仍以化療為主，完全緩解率60．80％，但大多不可治愈，最終會死于白血病復發(fā)。對于急性白血病發(fā)病機制及治療的研究，是惡性血液病研究領域的熱點之一，其中有關(guān)細胞凋亡及細胞周期的調(diào)控機制是目前重要的研究內(nèi)容。環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，cox-2)為前列腺素合成過程中

2、的限速酶，其基因定位于1號染色體的1q2￡2瑙一，約8．3kb，由9個內(nèi)含子和10個外顯子構(gòu)成，可編碼604個氨基酸殘基組成的多肽。大量實驗證實，COX-2在多種白血病細胞均高表達，且具有一定的促細胞增殖、抗細胞凋亡、促血管新生及誘導細胞耐藥的作用。細胞周期蛋白Dl(cycl／nDI)與El(cyclinEl)為公認的癌基因，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起調(diào)控作用。CyclinDl與細胞周期素依賴性激酶4／6(cyclindependentkinase4／6，CDK4／6)結(jié)合使抑癌基因pRb磷酸化，從而解除轉(zhuǎn)錄因子E2F家族的抑制作用，推動細胞由G1期進入S期，使得細胞增殖加速

3、。CyglinEl為一種癌基因，定位于19q12染色體，與CDK2結(jié)合形成CCNEl／CDK2復合物，使pRb磷酸化，調(diào)節(jié)細胞周期Gl—S期的過渡，促進細胞的增殖。塞來昔布作為一種選擇性COX-2抑制劑，其抗白血病作用機制尚未明確。本研究通過體外培養(yǎng)急性髓系細胞白血病細胞株HL-60細胞，觀察塞來昔布對HL．60細胞增殖、凋亡與細胞周期分布的影響，并檢測COX-2、cyclinDl、cyclinElmRNA表達水平的變化，初步探討塞來昔布抗白血病的可能機制。方法：不同濃度塞來昔布作用人急性白血病細胞株甩-60細胞24h后，系用CCK．8法測定細胞增殖活性，收集上述細胞進行

4、瑞特．吉姆薩染色，觀察細胞形態(tài)變化，在上述實驗基礎上應用流式細胞技術(shù)分析細胞凋亡及細胞周期分布的變化，利用定量R1’-PCR的方法檢測細胞周期蛋白Dl、El及COX．2mRNA的表達水平變化。所得結(jié)果運用SPSSl7．0統(tǒng)計中文摘要軟件包處理，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標準差(；士s)表示，兩樣本均數(shù)的比較用t檢驗，多個樣本均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，以LSD-t檢驗做多個樣本均數(shù)間的兩兩比較，以ow0．05為顯著性檢驗水準，IC50值的計算用回歸分析。結(jié)果：l塞來昔布對HL-60細胞增殖的影響：終濃度為20、40、60、80、100、120、160umol／L的塞

5、來昔布分別作用于HL-60細胞24h，對}玎．一．60細胞增殖均有抑制作用，其抑制率分別為(17．31±1．15)％、(30．94±1．93)％、(48．84±1．69)％、(79．27±1．15)％、(89．18±1．73)％、(94．74±1．50)％、(94．60±0．87)％，24h的IC50值為63．037umol。各濃度組組間進行兩兩比較，120與160umol／L濃度組之間差異無統(tǒng)計學意義(p>o．05)，其他各組間差異有統(tǒng)計學意義(剛．05)。結(jié)果顯示，塞來昔布對HL-60細胞有明顯的增殖抑制作用，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性(相關(guān)系數(shù)r--0．955)。實驗中

6、，120與160umol／L濃度組間差異無統(tǒng)計學意義(p>o．05)，其原因可能是在此濃度作用下HL-60細胞已被大量破壞所致。2塞來昔布作用下HL-60細胞形態(tài)學改變：收集CCK-8試驗中的細胞涂片，進行瑞特．吉姆薩染色，在光學顯微鏡下觀察，塞來昔布處理組細胞呈現(xiàn)典型凋亡形態(tài)學改變，表現(xiàn)為細胞體積縮小，核染色質(zhì)濃聚，核固縮，核碎裂，核邊集，可見新月核，凋亡小體形成，可見核發(fā)泡現(xiàn)象，細胞質(zhì)內(nèi)可見空泡，對照組細胞形態(tài)大致正常。120與160umol／L濃度組的細胞已被大量破壞，涂片鏡下可見大量細胞碎片，已無完整的細胞結(jié)構(gòu)。3流式細胞儀檢測塞來昔布對HL-60細胞凋亡的影響：

7、20、40、60umol／L塞來昔布作用于HL．60細胞24h后，碘化丙啶染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率分別為(10．04±0．15)％、(30．98±1．08)％、(57．15±0．69)％，均高于對照組(1．85±0．08)％(p