凋亡素基因重組腺病毒的構(gòu)建

《凋亡素基因重組腺病毒的構(gòu)建》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。

1、凋亡素基因重組腺病毒的構(gòu)建【摘要】目的構(gòu)建攜凋亡素基因的腺病毒載體，為進(jìn)一步研究凋亡素基因功能及其作用機(jī)制建立基礎(chǔ)。方法Pmel酶切線性化已經(jīng)構(gòu)建好的含凋亡素基因的穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMVVP3，然后電轉(zhuǎn)化到BJ5183AD1細(xì)胞中進(jìn)行同源重組。PacⅠ酶切出含凋亡素基因的腺病毒DNA，然后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行包裝獲得重組腺病毒，運(yùn)用RTPCR鑒定重組腺病毒。用氯化銫梯度離心純化病毒。用物理和生物方法確定病毒的滴度。結(jié)果PacⅠ酶切證實(shí)同源重組成功。綠色熒光觀察證實(shí)病毒包裝成功并且具有感染力，RTPCR證實(shí)了重組腺病毒具有凋亡素蛋白的編碼。重組腺

2、病毒的濃度為84.52×109VP/ml，滴度為6.561×109PFU/ml。結(jié)論成功構(gòu)建含凋亡素基因的重組腺病毒，它的滴度足以滿足體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)。【關(guān)鍵詞】凋亡素基因腺病毒載體基因治療【Abstract】ObjectiveToconstructarecombinantadenoviruscarryingApoptingenesoastoprovidebasisforfurtherstudyingApoptingenefunctionsandascertainingcorrespondingmechanism.MethodsTheshuttlevectorpAdT

3、rackCMVVP3containingApoptingenewaslinearizedwithPmelandsubsequentlyelectrotransformedintoBJ5183AD1cellsforhomologousrecombination.TheDNAcontainingApoptingeneofthe13recombinantadenoviruswasobtainedbydigestingwithPacIandthentransfectedinto293cells,wheretherecombinantadenovirusconta

4、iningApoptingenewasidentifiedbyRTPCRandpurifiedbycesiumchoridedensitycentrifugation.Finally,thetitreoftherecombinantadenoviruswasdeterminedbybiologicalandphysicalassays.ResultsDigestionwithPacIprovedsuccessfulhomologousrecombination.Greenfluorescenceshowedsuccessfulrecombinantadenov

5、iruswithinfectiveness.RTPCRconfirmedthattherecombinantadenovirushadcodingofApoptingeneproteins.Thetitreoftherecombinantadenoviruswas84.52×109VP/mland6.561×109PFU/ml.ConclusionTherecombinantadenovirusvectorcontainingApoptingeneissuccessfullyconstructed,withitstitresufficientforinvivo

6、andinvitroexperiment.【Keywords】Apoptingene;Adenovirusvector;Genetherapy凋亡素，又稱Apoptin(apoptosisinduction)［1］，是來(lái)源于雞貧血病毒(chickenanemia13virus,CAV)的小分子蛋白質(zhì)。它能引發(fā)一些腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)此作用。在腫瘤的治療上具有巨大潛力［1］。由于凋亡素是外來(lái)物質(zhì)，在發(fā)揮作用前必須進(jìn)入細(xì)胞，所以我們選擇腺病毒作為載體來(lái)運(yùn)載它，以期能探索它的作用機(jī)制，為腫瘤的治療提供新的途徑。1材料與方法1.1含凋亡素基因的穿梭質(zhì)粒

7、PAdtrackCMVVP3的獲得［2］我們已經(jīng)成功構(gòu)建了含凋亡素基因的穿梭質(zhì)粒，并且通過(guò)了酶切和測(cè)序鑒定，為下一步實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)［2］。1.2含凋亡素基因的腺病毒基因組(PAdVP3)質(zhì)粒的構(gòu)建1.2.1同源重組pAdTrackCMVVP3用Pmel酶切，線性化，再用堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP)進(jìn)行去磷酸化處理，最后電轉(zhuǎn)化(BioRadGenePulserElectropoerator2500V200Ωmax)到BJ5183AD1細(xì)胞中，與其內(nèi)的pAdEasy1進(jìn)行同源重組。設(shè)置陰性對(duì)照組為空載體pAd

8、TrackCMV，經(jīng)過(guò)