水貂生長(zhǎng)激素基因重組腺病毒的構(gòu)建

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1、水貂生長(zhǎng)激素基因重組腺病毒的構(gòu)建摘要眾所周知，水貂是一種具有很高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的毛皮動(dòng)物，研究表明，其皮張的大小和皮毛的質(zhì)量除了與種系，營(yíng)養(yǎng)水平和飼養(yǎng)管理等因素有關(guān)外，還與水貂的生理狀況密切相關(guān)。水貂生長(zhǎng)激素(minkgrowthhormone，mGH)是由水貂腦垂體前葉細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)激素，它是具有廣泛的生理功能。實(shí)驗(yàn)證明，人工注射動(dòng)物自身的生長(zhǎng)激素，可以明顯加快其生長(zhǎng)速度，增加體長(zhǎng)，提高毛皮質(zhì)量。但從水貂腦垂體提取天然生長(zhǎng)激素產(chǎn)量甚微，難以大范圍的應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐，而基因工程技術(shù)和病毒載體的發(fā)展為有

2、效的解決這一問(wèn)題提供了可能。本文主要利用腺病毒載體來(lái)生產(chǎn)基因工程水貂生長(zhǎng)激素。首先，在本室水貂生長(zhǎng)激素基因真核表達(dá)載體的相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，將使水貂增重明顯的雙啟動(dòng)子調(diào)控下的水貂生長(zhǎng)激素基因真核表達(dá)載體pCMTmGH瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞(倉(cāng)鼠腎細(xì)胞)，48小時(shí)后取培養(yǎng)液，濃縮后經(jīng)SDS．PAGE和免疫印跡檢測(cè)，結(jié)果表明在22KD附近有目的條帶，證明該載體可以在真核細(xì)胞中表達(dá)水貂生長(zhǎng)激素。為之后采用雙啟動(dòng)子構(gòu)建水貂生長(zhǎng)激素基因重組腺病毒穿梭質(zhì)粒提供依據(jù)。然后，根據(jù)需要設(shè)計(jì)兩端分別帶有Hin鋤和Kp

3、nI酶切位點(diǎn)的水貂生長(zhǎng)激素基因特異性PCR引物，將擴(kuò)增出來(lái)的水貂生長(zhǎng)激素基因連到pEasy．T載體上，構(gòu)建成pTmGH克隆載體，經(jīng)酶切及測(cè)序結(jié)果表明已成功地?cái)U(kuò)出水貂生長(zhǎng)激素基因并將上述兩個(gè)酶切位點(diǎn)加到水貂生長(zhǎng)激素基因的兩端。分別用pCMTmGH上的CMV-MT雙啟動(dòng)子和pTmGH上的水貂生長(zhǎng)激素基因置換pAEMTCD上的MT啟動(dòng)子和豬生長(zhǎng)激素cDNA，構(gòu)建成雙啟動(dòng)子調(diào)控下的水貂生長(zhǎng)激素基因重組腺病毒穿梭質(zhì)粒p／kECMTmGH，經(jīng)酶切及序列測(cè)定，證實(shí)已成功構(gòu)建復(fù)制缺陷型的水貂生長(zhǎng)激素基因重組腺病毒穿

4、梭質(zhì)粒。最后，利用人類腺病毒載體，將水貂生長(zhǎng)激素基因重組腺病毒穿梭質(zhì)粒與含有腺病毒DNA大片段的包裝質(zhì)粒pBHGE3共同轉(zhuǎn)染進(jìn)入293FT細(xì)胞，使其在293FT細(xì)胞中發(fā)生同源重組，經(jīng)電鏡和PCR鑒定，已成功構(gòu)建出CMV和MT雙啟動(dòng)子調(diào)控下的水貂生長(zhǎng)激素基因重組腺病毒。關(guān)鍵詞：水貂，生長(zhǎng)激素基因，腺病毒載體ConstructionofrecombinantadenovirusofminkgrowthhormonegeneAbstractAseveryoneknowsthattheminkisakind

5、offuranimalwhichhashi【gheconomyvalue．Bytheresearch，thesizeandthequalityoftheskinarenotonlyaboutwiththedifferentspecies，thenourishmentandfeedinglevel，butalsocloselyrelatedwiththephysiologyconditionofthemink．Theminkgrowthhormone(mGH)isakindofproteinhormo

6、newhichexcretedfromthebrainadenohypophysiscells；ithastheextensivephysiologyfunction．IfthegrowthhormoneWasinjectedtotheanimals’bodies，itcouldobviouslyincreasetheirgrowingspeed，andincreasebodies’length，raisingthefurrieries’quality．Butthenaturalgrowthhorm

7、oneyieldisverytiny．It’Shardtowide—rangingcontentneed，nevertheless．Thedevelopmentofgeneticengineeringtechniqueandvirusvectorcarryresolvesthisproblemeffectively．Inthispaper,usingadenovirusvectortoproducegeneticallyengineeredgrowthhormoneMinkFirstly，asthe

8、resultsonanimalexperimentofminkwiththegrowthhormonegeneeukaryoticexpressionvector,wetransienttransfectedtheminkgrowthhormonegeneeukaryoticexpressionvectorpCMTmGHinBHKcells，andgettheculturefluidbySDS·PAGEdetectionafter48hours．theresultsh