人canstatin基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及其病毒制備

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1、人canstatin基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及其病毒制備【摘要】目的：利用HEK293細(xì)胞內(nèi)同源重組法構(gòu)建帶有綠色熒光蛋白報(bào)告基因的人血管能抑素（canstatin）重組腺病毒載體，擴(kuò)增并純化重組腺病毒顆粒.方法：PCR法擴(kuò)增canstatin全長(zhǎng)基因，克隆至pGEMT載體，經(jīng)酶切和測(cè)序證實(shí)后，亞克隆到穿梭質(zhì)粒pAd5CMV中，獲得穿梭質(zhì)粒pAd5CMV/canstatin.用PacI酶單獨(dú)酶切穿梭質(zhì)粒pAd5CMV/canstatin和腺病毒E3區(qū)帶有綠色熒光蛋白表達(dá)元件的腺病毒骨架載體，采用標(biāo)準(zhǔn)的磷

2、酸鈣方法共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞.7~10d后收獲細(xì)胞裂解物，在HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增，病毒顆粒經(jīng)氯化銫密度梯度離心純化后，分光光度計(jì)檢測(cè)重組病毒滴度.結(jié)果：測(cè)序證實(shí)pEGMT/canstatin基因片段與GenBank公布的canstatin基因序列一致.重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后24h觀察到綠色熒光,病毒純化后制備出高滴度重組腺病毒(病毒滴度為2.0×1015pt/L).結(jié)論：成功構(gòu)建了表達(dá)canstatin基因的重組腺病毒載體并制備了重組腺病毒顆粒，為研究該基因在腫瘤治療中的作用奠定了基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】

3、腺病毒載體；血管能抑素；綠色熒光蛋白質(zhì)類0引言自Folkman提出“腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移都依賴于新生血管的生成”概念以來，腫瘤的抗血管治療一直受到人們的重視.近年的研究［1-2］認(rèn)為，通過上調(diào)抑血管生成因子表達(dá)或/和下調(diào)促血管形成因子的表達(dá)，均可抑制腫瘤血管的新生，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的.目前臨床上已有數(shù)種抑制新生血管形成的藥物用于抗腫瘤治療，還有許多類似藥物處于基礎(chǔ)研究之中，并已顯示出良好的應(yīng)用前景［3-4］.血管能抑素(canstatin)是繼血管生成抑素(angiostatin)和內(nèi)皮抑素(endosta

4、tin)之后，最新發(fā)現(xiàn)的于血管基底膜Ⅳ型膠原的腫瘤血管生成抑制因子.但利用腺病毒研究其抑制血管的研究報(bào)道國(guó)內(nèi)外尚少見.本研究克隆canstatin基因序列，并利用我們經(jīng)過改良的腺病毒載體構(gòu)建方法，構(gòu)建表達(dá)canstatin基因的腺病毒載體，為進(jìn)一步研究其抗腫瘤作用提供依據(jù).1材料和方法1.1材料限制性內(nèi)切酶：SalⅠ，SpeⅠ，EcoRⅠ，ClaⅠ，XhoⅠ，PacⅠ和T4連接酶(美國(guó)Fermentas公司);TaqDNA聚合酶(大連TaKaRa公司);DNAladdermarker(西安Hybigen公司);

5、IPTG，XGal(上海Sangon公司)；pGEMT試劑盒(美國(guó)Promega公司);質(zhì)粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒(上海AXYGEN公司);人cDNA文庫和宿主菌E.coliDH10B由陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院基因治療研究室保存；凝膠圖像分析儀(上海復(fù)日科技公司);高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司);熒光顯微鏡及顯微熒光攝影系統(tǒng)(德國(guó)Zeiss公司).引物序列:Forin,94℃30s，55℃30s，72℃60s，72℃10min，其中PCR共30個(gè)循環(huán).取上述PCR產(chǎn)物20μL在10g/L瓊脂

6、糖凝膠上電泳，回收700bp的目的基因.回收產(chǎn)物以4∶1的比例連接入pGEMT載體，22℃過夜.轉(zhuǎn)化E.coliDH10B大腸桿菌，在Amp+LB平板上37℃培養(yǎng)12~14h，挑取陽性克隆，加入5mL含Amp的LB培養(yǎng)基中37℃搖菌16~18h.收集菌液并提取質(zhì)粒，EcoRⅠ酶切，電泳鑒定正確后，選一單克隆送公司測(cè)序，命名為pGEMT/canstatin.1.2.2穿梭質(zhì)粒載體的構(gòu)建將pGEMT/canstatin質(zhì)粒DNA用ClaⅠ和SpeⅠ雙酶切，連接到使用同樣酶切的帶有綠色熒光蛋白（eGFP）熒光的

7、穿梭質(zhì)粒pAd5CMV中，轉(zhuǎn)化DH10B,Amp+LB平板篩選、挑取陽性克隆、搖菌16~18h后提取質(zhì)粒，XhoⅠ和SalⅠ酶切鑒定，構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體pAd5CMV/canstatin.酶切鑒定后，過柱法中提質(zhì)粒，200μLddH2O溶解并定量.1.2.3腺病毒的重組、擴(kuò)增和滴度測(cè)定穿梭質(zhì)粒載體pAd5CMV/canstatin經(jīng)PacⅠ酶切使其線性化后，與同樣用PacⅠ酶切的腺病毒骨架載體采用磷酸鈣法共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞.2d后用熒光顯微鏡觀察，7～10d后收集細(xì)胞，離心沉淀后，在37℃和-80℃反復(fù)凍

8、融3次，4℃,2500g離心10min，收集病毒上清，再次使用上清感染HEK293細(xì)胞以擴(kuò)增重組病毒、氯化銫密度梯度離心純化，分光光度計(jì)檢測(cè)重組病毒含量.2結(jié)果2.1目的片段的克隆和鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠700bp左右顯示為1條帶，與canstatin基因預(yù)計(jì)大小(含酶切位點(diǎn))一致(圖1).純化的PCR產(chǎn)物克隆到載體后經(jīng)EcoRⅠ酶切，瓊脂糖電泳上可見1號(hào)，3號(hào)，6號(hào)克隆在78