hvegfa基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染效率的研究

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1、hVEGFA基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染效率的研究：李慧勇，袁志誠，陳波，陸培松，李巧玉，曹侃【摘要】目的：應(yīng)用AdEasy復(fù)制缺陷型腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建攜帶hVEGFA基因的重組腺病毒載體。方法：采用分子克隆技術(shù)，從PCR2.1hVEGFA質(zhì)粒中克隆出hVEGFA基因的編碼序列，酶切、連接后，插入腺病毒系統(tǒng)中的穿梭載體pAdTrackCMV，獲得重組質(zhì)粒pAdTrackCMVhVEGFA，將其轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架載體pAdeasy1的大腸埃希菌BJ5183，進行同源重組，獲得重組子pAdeasy1hVEGFA。鑒定后

2、,將pAdeasy1hVEGFA轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞(HEK293A細(xì)胞)，獲得含hVEGFA基因的重組腺病毒(rAdhVEGFA)。反復(fù)感染HEK293A細(xì)胞擴增腺病毒，50%組織培養(yǎng)感染量法(TCID50)檢測病毒滴度，熒光顯微鏡觀測綠色熒光蛋白(GFP)的表達。結(jié)果：成功構(gòu)建出含有hVEGFA基因的腺病毒載體rAdhVEGFA，轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞后出現(xiàn)綠色熒光蛋白表達，證明腺病毒載體rAdhVEGFA轉(zhuǎn)染成功，通過反復(fù)感染HEK293A細(xì)胞獲得大量病毒。結(jié)論：成功構(gòu)建含有hVEGFA基因的腺病毒載體rAdhVEGFA

3、，可為缺血性腦血管疾病的基因治療提供基因載體?！娟P(guān)鍵詞】hVEGFA基因;腺病毒載體;轉(zhuǎn)染;缺血性腦血管疾病　[Abstract]Objective:ToconstructtherebinantadenovirusvectorcontaininghVEGFAgene.Methods:ThehVEGFAgenecodingsequenceidtogetpAdTrackCMVhVEGFA,edintopetentE.coliBJ5183carriedbackboneplasmidpAdeasy1already.Thehomolog

4、ousrebinantadenoviralplasmidplifiedinHEK293Acells.ViralparticleconcentrationinedbyTCID50.Results:Therebinantadenovirusvectoriccerebrovasculardisease′sgenetherapy.　　[Keyiccerebrovasculardisease(ICVD)　　血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgroeⅠ、PacⅠ(NEB公司)，質(zhì)粒大、小量制備試劑盒(AxyPrep公司);

5、Lipofectamin2000(Invirogen公司)?！　?.2方法　　1.2.1目的基因hVEGFA的克隆　　上海生工生物技術(shù)有限公司合成引物，P1:5′CGCAGATCTATGAACTTTCTGCTGTCTTGG3′;P2:5′AAGCTCGAGTCACCGCCTCGGCTTGTCACA3′。以PCR2.1hVEGFA質(zhì)粒為模板行PCR，退火溫度為60℃，PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，于長波紫外線透視儀下，切下大小為576bp的hVEGFA的cDNA條帶，膠回收hVEGFA的cDNA片段。用普通DNA聚合

6、酶進行加堿基A尾延伸反應(yīng)后，再用T4DNA連接酶將hVEGFAcDNA與pMDTM18T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，涂在氨芐青霉素抗性(終濃度為50mg/ml)的LB平板上，置37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。從每個培養(yǎng)皿上各挑取2個單克隆菌落分別接種于3ml含氨芐青霉素抗性(終濃度為50mg/ml)的LB培養(yǎng)液中，置37℃恒溫?fù)u床(250r/min)培養(yǎng)過夜。試劑盒提取質(zhì)粒,同時送至上海生物工程公司測序分析。從上、下游兩端進行核苷酸全序列分析，其結(jié)果經(jīng)生物信息學(xué)分析及BLAST軟件分析，以驗證重組質(zhì)粒的正確性?！　?.2.2

7、穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMVhVEGFA的構(gòu)建　　將pMDTM18T載體hVEGFA用BglⅡ和XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠回收試劑盒回收576bp的酶切產(chǎn)物，溶于蒸餾水備用。同時將穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV用BglⅡ和XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠回收試劑盒回收10kb的酶切產(chǎn)物，溶于蒸餾水備用。用T4DNA連接酶將以上獲得的兩個酶切產(chǎn)物進行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，涂在卡那霉素抗性(終濃度為50mg/ml)的LB平板上37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜

8、。從每個培養(yǎng)皿上各挑取3個單克隆菌落接種于3ml含卡那霉素抗性(終濃度為50mg/ml)的LB培養(yǎng)液中，37℃恒溫?fù)u床(250r/min)培養(yǎng)過夜。試劑盒提取質(zhì)粒,BglⅡ、XhoⅠ雙酶切鑒定陽性克隆,同時送至上海生物工程公司測序分析