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1、人白介素24基因重組腺病毒載體構(gòu)建及鑒定【摘要】目的構(gòu)建含有人白介素24（hIL-24）基因的重組腺病毒載體，為下一步病理性瘢痕的基因治療研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法采用基因工程技術(shù)將hIL-24基因的cDNA亞克隆至穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV上,鑒定正確后在PAdEasy系統(tǒng)中進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)同源重組，通過(guò)脂質(zhì)體將正確重組體包裹并轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞以包裝并擴(kuò)增病毒。采用酶切及PCR方法對(duì)重組腺病毒進(jìn)行鑒定。結(jié)果酶切和PCR結(jié)果證實(shí)hIL-24基因重組腺病毒載體構(gòu)建成功并可在293A細(xì)胞中表達(dá)，病毒滴度達(dá)107pf
2、u/ml。結(jié)論成功構(gòu)建了有較強(qiáng)感染能力的含hIL-24基因的重組腺病毒載體?！娟P(guān)鍵詞】hIL-24；腺病毒；病理性瘢痕TheconstructionandIdentificationofRecombinantAdenovirusVectorofhIL-24LIANGJie,HEHai-tianPENGZhi,etal.DepartmentofPlasticSurgery,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524001,Guangdong
3、ProvinceChina【Abstract】ObjectiveToconstructandidentifytherecombinantadenovirusvectorofhumanIL-24geneforfuturegenetherapyofpathologicalscartissue.10MethodsThehumanIL-24genefragmentwasclonedintotheshuttleplasmidpAdTrack-CMVtoformthetransfervectorbythemethodo
4、fhomogenousrecombinationinbacteriaofPAdEasysystem.Thentherightrecombinantadenoviruswastransfectedinto293AcellsusingLipofectine2000.Therecombinantadenovirusvectorwasidentifiedbyrestrictionenzymedigestionandpolymerasechainreaction(PCR).ResultsRestrictionendo
5、nucleaseandPCRanalysisconfirmedthatthehumanIL-24genewassuccessfullyinsertedintotheadenovirusvector.Thetiteroftherecombinantadenoviruswas107pfu/ml.ConclusionTherecombinantadenovirusvectorofhIL-24wassuccessfullyconstructedwithhighlyinfection.【Keywords】HumanI
6、L-24gene;Adenovirus;Pathologicalscar10人白介素24基因（hIL-24）是一種腫瘤抑制基因，通過(guò)多種途徑抑制、誘導(dǎo)、細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞有選擇性殺傷作用而對(duì)正常組織幾乎無(wú)毒副作用，并且具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能，是當(dāng)今人們研究的熱點(diǎn)[1]。目前已經(jīng)在多種腫瘤如前列腺癌、肺癌等的腫瘤基因治療方面取得實(shí)驗(yàn)成功[2]。近年來(lái)許多研究表明病理性瘢痕的形成與細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞因子、癌基因等密切相關(guān)。然而hIL-24基因與病理性瘢痕的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。我們過(guò)往的研究表明hIL-24基因在
7、增生性瘢痕內(nèi)的表達(dá)水平與正常皮膚組、普通瘢痕組的相比較明顯降低，提示hIL-24基因在增生性瘢痕的形成過(guò)程中起著重要作用，可能與IL-24基因在組織中的表達(dá)低下有關(guān)[3]。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建含有hIL-24基因的重組腺病毒載體，為下一步病理性瘢痕的基因治療研究做基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料1.1.1試劑：PmeI、PacI、BglⅡ及XhoI購(gòu)自NEB公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒及PCR產(chǎn)物
8、回收試劑盒購(gòu)自Takara公司；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；Trizol總RNA提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。1.1.2菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞株：pAdtrack-CMV、AdEasy-1及菌種BJ5183（AdEasier-1細(xì)菌）購(gòu)自Stratrgene公司；DH5a、293A細(xì)胞由本研究所保存。1.2方法主要參照文獻(xiàn)[4-5]操作。101.2.1目的基因的獲取采用Trizol總RNA
