人ctla4ig基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定

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1、人CTLA4Ig基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定【摘要】目的：用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建CTLA4Ig重組腺病毒，以感染樹突狀細胞使其遞呈抗原至T淋巴細胞功能受阻.方法：雙酶切、凝膠回收方法從質(zhì)粒pCDM8CTLA4Ig提取目的基因CTLA4Ig，構(gòu)建成腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrackCTLA4Ig；經(jīng)酶切線性化后的pAdTrackCTLA4Ig與AdEasy1進行同源重組，經(jīng)酶切線性化轉(zhuǎn)染入HEK293細胞進行包裝.結(jié)果：卡那霉素抗性篩選和PacⅠ酶切確證重組腺病毒質(zhì)粒pAdCTL

2、A4Ig,PacⅠ酶切產(chǎn)生30kb和4.5kb2個片斷為同源重組.重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)293細胞包裝后可觀察到綠色熒光，收獲病毒并制備出高滴度重組腺病毒（病毒滴度為1.6×109）.結(jié)論：成功構(gòu)建了攜帶CTLA4Ig基因的重組腺病毒載體，為利用CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染樹突狀細胞的基因治療奠定了基礎.【關鍵詞】CTLA4Ig基因；腺病毒科；遺傳工程　　【Abstract】AIM:Toconstructrebinantadenovirusvectorcarryingthehumancytotoxiclym

3、phocyteantigen4immunoglobulin(CTLA4Ig)geneandamplifytheadenovirusvectorinHEK293cells,andthentoinfectdendriticcellstoblockthesubmissionofantigenfromdendriticcellstoTlymphocytes.METHODS:CTLA4IggeneesitepCDM8CTLA4Igvector,thensubclonedintotheshuttlepla

4、smidpAdTrackCMVafterdigestedbythesameenzyme.TherebinantplasmidpAdTrackCTLA4IglinearizedbyPmeI,icallytransfectedintoE.coliBJ5183cellsthathadbeenchemicallytransfectedidpAdEasy1.Finally,thelinearizedrebinantplasmidycinresistenceandconfirmedbyPacI.Ther

5、estrictiveendonucleaseanalysisconfirmedthatcorrectrebinantadenovirusplasmidentsphocyteantigen4immunoglobulin,CTLA4Ig），與樹突狀細胞表面分子B7結(jié)合，即可阻斷T細胞表面分子CD28與B7結(jié)合，降低T細胞的活化，則可能阻斷過敏反應產(chǎn)生.本研究擬構(gòu)建可轉(zhuǎn)染樹突狀細胞的表達CTLA4Ig的腺病毒體系［2-3］.　　1材料和方法　　1.1材料　　質(zhì)粒pCDM8CTLA4Ig(HindⅢ,

6、XbaⅠ)（第三軍醫(yī)大學燒傷外科研究所羅高興博士惠贈），穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV及骨架質(zhì)粒pAdEasy1（芝加哥大學TC.He博士惠贈），大腸桿菌BJ5183、DH5α（重慶醫(yī)科大學病毒性肝炎研究所），PCR試劑盒,DNALigationKit試劑盒、限制性內(nèi)切酶HindⅢ,XbaⅠ,Trizol試劑、小量質(zhì)粒提取試劑盒,DNA片斷純化試劑盒（TaKaRa公司），限制性內(nèi)切酶PacⅠ,PmeⅠ（NEB公司），LipofectamineTM2000（Invitrogen公司），PCR引

7、物由上海鼎安生物技術(shù)有限公司合成，CTLA4Ig引物序列為上游：5′ATGGGTGTACTGCTCACACAG3′；下游為：5′TCATTTACCCGGAGACAGG3′.　　1.2方法［4］　　1.2.1雙酶切法質(zhì)粒pCDM8CTLA4Ig被在大腸桿菌中擴增后，以HindⅢ和XbaⅠ雙酶切獲與理論片斷相符的CTLA4Ig片斷，用凝膠回收試劑盒回收；腺病毒穿梭質(zhì)粒載體pAdTrackCMV被HindⅢ和XbaⅠ雙酶切后呈開環(huán)狀，在16℃下與回收的CTLA4Ig片斷經(jīng)DNALigationKi

8、t連接.連接后產(chǎn)物被轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，提取的質(zhì)粒pAdTrackCTLA4Ig以HindⅢ和XbaⅠ雙酶切后鑒定.　　1.2.2轉(zhuǎn)化將骨架質(zhì)粒pAdEasy1轉(zhuǎn)化至BJ5183,并制備BJAdEasy1的感受態(tài)，經(jīng)PmeⅠ單酶切的pAdTrackCTLA4Ig加入BJAdEasy1感受態(tài)進行轉(zhuǎn)化，提取的質(zhì)粒經(jīng)PacI單酶切鑒定.　　1.2.3轉(zhuǎn)染、包裝　　1.2.3.1HEK293細胞的培養(yǎng)HEK293（人胚腎）細胞于含100mL/L胎牛血清的1640培養(yǎng)基，37℃,50mL