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1、免疫電鏡技術(shù)運(yùn)用過(guò)程中電子染色方法的選用作者：趙承軍，張東梅，鄧其躍，陳鵬慧，蔡文琴，陶忠芬，張吉強(qiáng)【摘要】目的探究免疫電鏡不同染色方法對(duì)免疫組化陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的關(guān)系。方法組織切片經(jīng)常規(guī)免疫組化（雌激素受體GPR30）并行DAB-硫酸鎳銨顯色后進(jìn)行電鏡切片，然后分為雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染、雙氧鈾單染與未染色3組，以便對(duì)不同電子染色結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果GPR30免疫陽(yáng)性產(chǎn)物位于細(xì)胞核外的膜性結(jié)構(gòu)上，在鈾-鉛雙染組顯示很高的電子密度，但是背景染色也很深，在鈾單染組的反差比較好，而未染色組的反差更好。結(jié)論免疫電鏡技術(shù)中針對(duì)不同
2、的免疫陽(yáng)性反應(yīng)選用不同的電子染色方法，有利于陽(yáng)性結(jié)果的判斷與鑒別?！娟P(guān)鍵詞】免疫電鏡技術(shù)；雌激素受體；海馬；電子染色 Abstract:ObjectiveToexploredifferentimmunoelectronicstainingmethodsontheultralocalizationofimmunohistochemistry.MethodsThenovelmembranereceptorGPR30immunohistochemistrywithDAB-nickelintensificationwasap
3、plied,thenultrathinsectionswerepreparedanddifferent8eletronicstaining(citricleadplusdioxydateuranium,dioxydateuranium-onlyornoelectrostaining)wascarriedout.ResultsUnderlightmicroscope,GPR30showedverystrongimmunoreactivityinthehippocampalpyramidalneurons.Underele
4、ctronicmicroscope,theblankstaining(noelectrostaining)sectionsshowedthehighestcontrast,whilethedoublestainingsectionsshowedthelowestcontrast.ConclusionFordifferentimmunoreactiveintensity,differentelectronicstainingwassuggested. Keywords:immunoelectronicmicroscop
5、e;estrogenreceptor;hippocampus;electronicstaining 免疫電鏡標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)方面［1-2］，它能在超微結(jié)構(gòu)水平上精確、細(xì)致地定位，特異性高，方法簡(jiǎn)便，優(yōu)越性十分顯著。而如何能成功確定免疫反應(yīng)陽(yáng)性區(qū)域并選取合適的區(qū)域是免疫電鏡成敗的關(guān)鍵。為此我們應(yīng)用免疫電鏡技術(shù)但選用不同的電子染色方式，以比較幾種電子染色的優(yōu)缺點(diǎn)，從而為免疫電鏡技術(shù)的開(kāi)展提供一些參考?！ ?材料與方法8 1.1動(dòng)物及分組 成年雌性SD大鼠共12只，體重（210±10）g，由第三軍醫(yī)大學(xué)
6、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（加抗體組）和空白對(duì)照組（不加抗體的陰性對(duì)照），實(shí)驗(yàn)組又分雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染色、雙氧鈾單染與未染色三組進(jìn)行對(duì)比觀察?！ ?.2主要試劑和藥品 羊抗兔GPR30（ab12563）多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，抗體稀釋液（antibodydiluentwithbackground-reducing,S302281）與羊抗兔EnVisionTM試劑盒（GK400305）購(gòu)自Dakocytomation公司，封閉血清、DAB顯色試劑盒等購(gòu)自北京中杉公司，其余試劑均為市售分析純?！ ?.3
7、儀器設(shè)備 TECNAI-10型透射電子顯微鏡（PHILIPS公司），超薄切片機(jī)（LKB公司）?！ ?.4免疫組織化學(xué)染色8 1.4.1動(dòng)物固定、取材動(dòng)物用5%水合氯醛麻醉，開(kāi)胸，經(jīng)左心室插管到主動(dòng)脈，剪開(kāi)右心耳，先后灌注生理鹽水200mL和4%多聚甲醛溶液300mL。灌注后取出大腦組織，分離海馬放入2.5%戊二醛溶液。然后用振蕩切片機(jī)制備海馬切片（片厚100μm），切片入2.5%戊二醛溶液后固定2h，用0.01mol/LPBSpH為7.2～7.4洗滌3次，每次1h，最后保存于4℃?zhèn)溆谩！ ?.4.2包埋前免疫電鏡步
8、驟按文獻(xiàn)［3-4］進(jìn)行。簡(jiǎn)述如下：3%H2O2封閉15min，0.01mol/LPBS漂洗后，用正常山羊血清封閉30min，然后加入一抗（GPR30，1∶200）于4℃孵育過(guò)夜。PBS漂洗后加入羊抗兔EnVisionTM試劑，室溫1h，0.01mol/LPBS漂洗后用硫酸鎳銨-DAB顯色5min。在解剖顯微鏡下選取免疫陽(yáng)性反應(yīng)區(qū)域
