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《免疫電鏡技術(shù)運用過程中電子染色方法的選用》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、免疫電鏡技術(shù)運用過程中電子染色方法的選用作者：趙承軍，張東梅，鄧其躍，陳鵬慧，蔡文琴，陶忠芬，張吉強【摘要】目的探究免疫電鏡不同染色方法對免疫組化陽性實驗結(jié)果影響的關(guān)系。方法組織切片經(jīng)常規(guī)免疫組化（雌激素受體GPR30）并行DAB-硫酸鎳銨顯色后進(jìn)行電鏡切片，然后分為雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染、雙氧鈾單染與未染色3組，以便對不同電子染色結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果GPR30免疫陽性產(chǎn)物位于細(xì)胞核外的膜性結(jié)構(gòu)上，在鈾-鉛雙染組顯示很高的電子密度，但是背景染色也很深，在鈾單染組的反差比較好，而未染色組的反差更好。結(jié)論免疫電鏡技術(shù)中針對不同的免疫陽性反應(yīng)選用不同的電子染色方法，有利于陽
2、性結(jié)果的判斷與鑒別。【關(guān)鍵詞】免疫電鏡技術(shù)；雌激素受體；海馬；電子染色 Abstract:ObjectiveToexploredifferentimmunoelectronicstainingmethodsontheultralocalizationofimmunohistochemistry.MethodsThenovelmembranereceptorGPR30immunohistochemistry,dioxydateuranium-onlyornoelectrostaining)icroscope,GPR30shomunoreactivityintheh
3、ippocampalpyramidalneurons.Underelectronicmicroscope,theblankstaining(noelectrostaining)sectionsshomunoreactiveintensity,differentelectronicstainingmunoelectronicmicroscope;estrogenreceptor;hippocampus;electronicstaining 免疫電鏡標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的各個方面［1-2］，它能在超微結(jié)構(gòu)水平上精確、細(xì)致地定位，特異性高，方法簡便，優(yōu)越性十分顯
4、著。而如何能成功確定免疫反應(yīng)陽性區(qū)域并選取合適的區(qū)域是免疫電鏡成敗的關(guān)鍵。為此我們應(yīng)用免疫電鏡技術(shù)但選用不同的電子染色方式，以比較幾種電子染色的優(yōu)缺點，從而為免疫電鏡技術(shù)的開展提供一些參考?！ ?材料與方法 1.1動物及分組 成年雌性SD大鼠共12只，體重（210±10）g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。隨機分為實驗組（加抗體組）和空白對照組（不加抗體的陰性對照），實驗組又分雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染色、雙氧鈾單染與未染色三組進(jìn)行對比觀察。 1.2主要試劑和藥品 羊抗兔GPR30（ab12563）多克隆抗體購自英國Abcam公司，抗體稀釋液（antibodyd
5、iluentation公司，封閉血清、DAB顯色試劑盒等購自北京中杉公司，其余試劑均為市售分析純?！ ?.3儀器設(shè)備 TEAI-10型透射電子顯微鏡（PHILIPS公司），超薄切片機（LKB公司）。 1.4免疫組織化學(xué)染色 1.4.1動物固定、取材動物用5%水合氯醛麻醉，開胸，經(jīng)左心室插管到主動脈，剪開右心耳，先后灌注生理鹽水200mL和4%多聚甲醛溶液300mL。灌注后取出大腦組織，分離海馬放入2.5%戊二醛溶液。然后用振蕩切片機制備海馬切片（片厚100μm），切片入2.5%戊二醛溶液后固定2h，用0.01mol/LPBSpH為7.2～7.4洗滌3次，每次
6、1h，最后保存于4℃?zhèn)溆??！ ?.4.2包埋前免疫電鏡步驟按 3討論 免疫電鏡在形態(tài)學(xué)研究中具有很廣泛的應(yīng)用，然而其染色程度卻很難控制，一般不容易得到理想的染色結(jié)果。免疫電鏡的標(biāo)記方法比較多，常用的標(biāo)記方法有膠體金標(biāo)記以及酶標(biāo)法。膠體金標(biāo)記的方法由于其顆粒大小一致，在電鏡下顯示清楚，所以有廣泛的應(yīng)用。但是，由于膠體金在光鏡下看不見而無法準(zhǔn)確定位，免疫組化是否成功、組織的陽性區(qū)域在什么位置無法明確，因而膠體金標(biāo)記的方法在一定程度上帶有一定的“盲目性”，最終使得免疫電鏡的工作量非常大而很難得到理想的結(jié)果?！ ∠啾戎拢笜?biāo)電鏡免疫組化就直觀很多，大大簡化了免疫電鏡
7、的工作量。在酶標(biāo)電鏡免疫組化技術(shù)中，由于抗體與抗原結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物是無色的，因此，還必須借助于組織化學(xué)方法將抗原抗體反應(yīng)部位顯示出來，最常用的顯色劑為DAB（其顯示結(jié)果為棕黃色）。DAB是廣泛應(yīng)用的電子供體之一，較敏感且終產(chǎn)物具有嗜鋨性，經(jīng)鋨酸處理，電子密度增加，適于在電鏡下確定抗原的存在部位［5］。盡管DAB標(biāo)記法存在陽性顆粒大小不均一，導(dǎo)致在電鏡下顯示效果不如膠體金的不足，但是通過DAB呈色反應(yīng)，在光鏡下可以清楚地確定組織切片中陽性細(xì)胞的位置，從而為成功進(jìn)行電鏡下觀察奠定了很好的基礎(chǔ)。這是膠體金標(biāo)記方法無法比擬的。 為了增強電子密度，一般都會在鋨酸處理
8、后用鈾-鉛
