化痰活血軟堅(jiān)法干預(yù)腎小球硬化機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究

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1、化痰活血軟堅(jiān)法干預(yù)腎小球硬化機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究【摘要】目的:探討化痰活血軟堅(jiān)法防治腎小球硬化的作用機(jī)理。方法:將Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組,模型組和中藥組。除正常組外,其余大鼠制成腎小球硬化大鼠模型。中藥組大鼠灌胃中藥(1mL/100g),其余兩組灌胃等量蒸餾水,共12w。然后觀察各組大鼠腎組織TGF-β1mRNA、TGF-β1及MMP-9mRNA的表達(dá)。結(jié)果:與模型組比較,中藥組大鼠腎組織TGF-β1和TGF-β1mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01),MMP-9mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)。結(jié)論:減少腎組織TGF-β1的產(chǎn)生和分泌、促進(jìn)MM

2、P-9mRNA表達(dá)是化痰活血軟堅(jiān)法發(fā)揮效應(yīng)的重要機(jī)理,而抑制TGF-β1mRNA的表達(dá)是減少TGF-β1產(chǎn)生和分泌的原因之一?!娟P(guān)鍵詞】化痰活血軟堅(jiān)法腎小球硬化TGF-β1MMP-9mRNA1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠,雄性,體重(180~200)g,山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號:SCXK(魯)20030004。61.1.2藥品與試劑化痰活血軟堅(jiān)湯由海藻、丹參、大黃、黃芪、當(dāng)歸組成。上藥水煎2次,大黃后入,濾取藥液合并,減壓濃縮(80℃)為0.4g/mL,低溫保存?zhèn)溆?。使用前放至室溫并搖勻。親和純化兔抗人多克隆T

3、GF-β1抗體:SantaCruzBiotechnology,Inc.產(chǎn)品;FITC-羊抗兔IgG、TGF-β1mRNA原位雜交試劑盒、MMP-9mRNA原位雜交試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。鹽酸多柔比星,深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號:0103E1,使用時(shí)以生理鹽水稀釋成1mg/mL的溶液。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1動(dòng)物分組將40只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組10只、模型組15只、中藥組15只,自由飲水進(jìn)食,1w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.2.2模型制備30只大鼠稱重,腹腔注射(0.2mL/100g體重)1.75%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液麻醉,從背部摘

4、除左腎,縫合傷口。正常組行假手術(shù),不摘除腎臟,余與上同。手術(shù)1w后,30只造模大鼠尾靜脈注射阿霉素5mg/kg,手術(shù)5w后注射阿霉素3mg/kg。正常組尾靜脈注射生理鹽水。1.2.3給藥方法第1次注射阿霉素1w后,中藥組灌服中藥(1mL/100g體重),正常組和模型組給予等量蒸餾水。連續(xù)給藥12w。61.2.4標(biāo)本采集摘取右腎,迅速冠狀切開,分別以10%甲醛和4%多聚甲醛(DEPC水配制)固定,石蠟包埋。甲醛固定組織切片厚度4μm,多聚甲醛固定組織切片厚度6μm。1.2.5指標(biāo)觀察1.2.5.1腎組織TGF-β1檢測采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。兔抗人T

5、GF-β1抗體1∶100稀釋,PBS代替一抗作為陰性對照。激光共聚焦顯微鏡觀察,并用LaserMicrscopeLSM510Version2.5SP2軟件處理,每張切片任選5個(gè)視野,計(jì)算其平均熒光強(qiáng)度,作為該樣本TGF-β1的相對表達(dá)量。1.2.5.2腎組織TGF-β1mRNA、MMP-9mRNA檢測采用原位雜交法。OLYMPUSBX41光學(xué)顯微鏡觀察,每張切片任選10個(gè)腎小球,OLYMPUSC-4000ZOOM數(shù)碼相機(jī)照相(光亮度設(shè)定一致),用Image-proplus4.5圖像分析軟件對結(jié)果進(jìn)行半定量分析,每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野,測定10個(gè)視

6、野的積分光密度,以均值作為該樣本MMP-9mRNA的相對表達(dá)量。1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)以SPSS11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析。2結(jié)果62.1各組大鼠腎組織TGF-β1mRNA、TGF-β1及MMP-9mRNA的表達(dá)結(jié)果見表1。由表1可知,模型組大鼠腎組織TGF-β1mRNA、TGF-β1表達(dá)顯著高于正常組(P<0.01),中藥組大鼠二者的表達(dá)顯著低于模型組(P<0.01)。模型組大鼠腎組織MMP-9mRNA表達(dá)比正常組顯著降低(P<0.01),而中藥組大鼠腎組織MMP-9mRNA表達(dá)則比模型組顯著升高

7、(P<0.01)。3討論TGF-β1是腎小球疾病進(jìn)展的重要介導(dǎo)因子,在免疫介導(dǎo)及非免疫介導(dǎo)的腎臟損傷模型中,系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及浸潤巨噬細(xì)胞均可合成TGF-β1。在慢性腎衰復(fù)雜的病理機(jī)制中,如腎小球的高灌注、高濾過,腎小管損傷和間質(zhì)纖維化,蛋白尿促進(jìn)腎小球間質(zhì)纖維化等多個(gè)環(huán)節(jié)均有TGF-β1參與。TGF-β1促進(jìn)系膜細(xì)胞產(chǎn)生部分ECM并抑制其降解,增加細(xì)胞對ECM的黏附,促進(jìn)ECM在腎小球內(nèi)積聚,并有調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的作用,從而直接參與腎小球硬化過程。腎臟病理組織學(xué)研究表明,在已有病變的腎小球中TGF-β61主要通過至少3種途徑促進(jìn)ECM的積聚:①促

8、進(jìn)ECM成分如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原和多種蛋白多糖的合成;②抑制ECM的降解,既抑制降解ECM成分的酶類如

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