化痰活血軟堅(jiān)法對腎小球硬化大鼠腎組織mmp

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1、化痰活血軟堅(jiān)法對腎小球硬化大鼠腎組織MMP【摘要】目的探討化痰活血軟堅(jiān)法防治腎小球硬化的作用機(jī)制。方法以化痰活血軟堅(jiān)方對腎小球硬化大鼠進(jìn)行干預(yù)，用SABC法和原位雜交法檢測大鼠腎組織MMP-2、TIMP-2、TIMP-2mRNA的表達(dá)，運(yùn)用圖像分析軟件對結(jié)果進(jìn)行半定量分析。結(jié)果化痰活血軟堅(jiān)方對模型大鼠腎組織MMP-2、TIMP-2、TIMP-2mRNA的表達(dá)均有顯著促進(jìn)作用，且使顯著下降的MMP-2/TIMP-2比值明顯回升。結(jié)論化痰活血軟堅(jiān)法調(diào)整MMP-2與TIMP-2之間的動態(tài)平衡是其防治腎小球硬化的重要機(jī)制。

2、【關(guān)鍵詞】化痰活血軟堅(jiān)法；腎小球硬化；MMP-2；TIMP-2基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)（MMPs）是促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）降解的主要酶系，與腎小球硬化密切相關(guān)?；祷钛泩?jiān)法是根據(jù)腎小球硬化的病理特點(diǎn)、發(fā)生機(jī)制以及中醫(yī)對其病因病機(jī)的認(rèn)識并結(jié)合中西醫(yī)藥防治腎小球硬化的經(jīng)驗(yàn)而確立的治療方法，依據(jù)治法筆者自擬處方進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果顯示對腎小球硬化有很好的防治作用。為探討該法的作用機(jī)理，對其影響腎小球硬化模型大鼠腎組織MMP-2及其抑制物TIMP-2表達(dá)的作用進(jìn)行了觀察。現(xiàn)報(bào)告如下。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1實(shí)

3、驗(yàn)動物MP-2多克隆抗體、親和純化兔抗TIMP-2多克隆抗體、生物素化山羊抗兔IgG、SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、TIMP-2mRNA原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。鹽酸多柔比星深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號:0103Ｅ1，使用時(shí)以生理鹽水稀釋成1ｍｇ/ｍｌ的溶液。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1實(shí)驗(yàn)動物分組將大鼠隨機(jī)分為正常組10只、模型組15只、中藥組15只，自由飲水進(jìn)食，1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.2.2模型制備大鼠稱重，腹腔注射0.2ml/100g體重1.75%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液麻醉。從背部

4、摘除左腎，縫合傷口。正常組行假手術(shù)，不摘除腎臟，余與上同。手術(shù)1周后，大鼠第一次尾靜脈注射阿霉素5mg/kg體重，手術(shù)5周后第二次注射阿霉素3mg/kg體重。正常組尾靜脈注射等量生理鹽水。1.2.3給藥第一次注射阿霉素1周后，中藥組灌胃給藥1ml/100g體重，正常組和模型組給予等量蒸餾水。連續(xù)給藥12周。實(shí)驗(yàn)過程中模型組6只死亡，中藥組死亡4只。1.2.4標(biāo)本的收集與處理摘取右腎，迅速冠狀切開，分別以10%甲醛和4%多聚甲醛（DEPC水配制）固定，石蠟包埋。甲醛固定組織切片厚度4μm，多聚甲醛固定的組織切片厚度6

5、μm。1.2.5腎組織MMP-2、TIMP-2免疫組化檢測采用SABC法檢測，兔抗大鼠MMP-2抗體和兔抗大鼠TIMP-2抗體1:100倍稀釋，PBS代替一抗作為陰性對照。OLYMPUSBX41光學(xué)顯微鏡觀察，每張切片任選10個(gè)腎小球，OLYMPUSC-4000ZOOM數(shù)碼相機(jī)照相（光亮度設(shè)定一致），用Image-proplus4.5圖像分析軟件對結(jié)果進(jìn)行半定量分析，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，測定10個(gè)視野的積分光密度，以均值作為該樣本MMP-2、TIMP-2的相對表達(dá)量。1.2.6腎組織TIMP-2mRNA檢測

6、采用原位雜交法。結(jié)果分析同上。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)以SPSS11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果模型大鼠腎組織MMP-2、TIMP-2、TIMP-2mRNA表達(dá)均減弱，且MMP-2/TIMP-2比值下降，差異有顯著性（P＜0.01）?；祷钛泩?jiān)方干預(yù)后模型大鼠腎組織MMP-2、TIMP-2、TIMP-2mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.01）。從MMP-2與TIMP-2的比值看，模型大鼠MMP-2/TIMP-2數(shù)值下降顯著（P＜0.01），化痰活血軟堅(jiān)方使二者比值明

7、顯回升（P＜0.01）。結(jié)果見表1、表2。表1對腎組織MMP-2、TIMP-2的影響：與模型組比較，※P＜0.01表2腎組織TIMP-2mRNA的表達(dá)注：與模型組比較，※P＜0.013討論基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）是一組可降解ECM的酶，是腎臟內(nèi)主要的基質(zhì)降解酶體系，其表達(dá)量及活性的高低直接影響著腎小球ECM的表達(dá)量和在局部的沉積。研究事實(shí)證明，MMPs活性下降是導(dǎo)致ECM成分在腎小球內(nèi)不斷積聚，從而導(dǎo)致腎小球硬化的重要機(jī)制之一。MMP-2屬于MMPs家族的明膠酶類，能降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原?，F(xiàn)已證實(shí)腎小球系

8、膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、包曼氏囊壁層上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、浸潤的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等能不同程度地表達(dá)MMP-2。生理狀態(tài)下，MMP-2和其抑制物TIMP-2處于相對平衡狀態(tài)，使有活性的MMP-2控制在一定范圍內(nèi)，從而使ECM的降解與合成也達(dá)到動態(tài)平衡，這對于維持腎小球?yàn)V過膜的完整具有重要意義。病理狀態(tài)下，MMP-2減少或TIMP-2增多，二者比例失