重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子凝膠(新增)

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1、重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子凝膠ChongzuNiuJianxingChengxianweiXibaoShengzhangyinziNingjiaoRecombinantBovineBasicFibroblastGrowthFactorGel本品系由高效表達(dá)牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的大腸桿菌，經(jīng)發(fā)酵、分離和高度純化后，加入凝膠基質(zhì)制成。含適宜穩(wěn)定劑、防腐劑，不含抗生素。1.基本要求生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原料及輔料、水、器具、動(dòng)物等應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》三部“凡例”的有關(guān)要求。2制造2.1工程菌菌種2.1.1名稱(chēng)及來(lái)源重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子工程菌株系由帶有牛堿性成纖維細(xì)

2、胞生長(zhǎng)因子基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株。2.1.2種子批建立應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的規(guī)定。2.1.3菌種檢定主種子批和工作種子批的菌種應(yīng)進(jìn)行以下各項(xiàng)全面檢定。2.1.3.1劃種LB瓊脂平板應(yīng)呈典型大腸桿菌集落形態(tài)，無(wú)其他雜菌生長(zhǎng)。2.1.3.2染色鏡檢應(yīng)為典型的革蘭氏陰性桿菌。2.1.3.3對(duì)抗生素的抗性應(yīng)與原始菌種相符。2.1.3.4電鏡檢查（工作種子批可免做）應(yīng)為典型大腸桿菌形態(tài)，無(wú)支原體、病毒樣顆粒及其他微生物污染。2.1.3.5生化反應(yīng)應(yīng)符合大腸桿菌生物學(xué)性狀。2.1.3.6牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)量在搖床中培養(yǎng)，應(yīng)不低于原始菌種的表達(dá)量。

3、2.1.3.7質(zhì)粒檢查該質(zhì)粒的酶切圖譜應(yīng)與原始重組質(zhì)粒相符。2.1.3.8目的基因核苷酸序列檢查（工作種子批可免做）目的基因核苷酸序列應(yīng)與批準(zhǔn)序列相符。2.2原液制備2.2.1種子液制備將檢定合格的工作種子批菌種接種于適宜的培養(yǎng)基（可含適量抗生素）中培養(yǎng)，供發(fā)酵罐接種用。2.2.2發(fā)酵用培養(yǎng)基采用適宜的不含抗生素的培養(yǎng)基。2.2.3種子液接種及發(fā)酵培養(yǎng)在滅菌培養(yǎng)基中接種適量種子液。在適宜溫度下進(jìn)行發(fā)酵，應(yīng)采用經(jīng)批準(zhǔn)的發(fā)酵工藝，并確定相應(yīng)的發(fā)酵條件，如溫度、PH值、溶氧、補(bǔ)料、發(fā)酵時(shí)間等。2.2.4發(fā)酵液處理用適宜的方法處理菌體。2.2.5純化采用經(jīng)批準(zhǔn)的純化工藝進(jìn)行純化，使其

4、達(dá)到3.1項(xiàng)要求，即為牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子原液。加入穩(wěn)定劑，除菌過(guò)濾后保存于適宜溫度，并規(guī)定其有效期。2.2.6原液檢定按3.1項(xiàng)進(jìn)行。2．3半成品制備采用的基質(zhì)應(yīng)符合凝膠劑基質(zhì)要求（附錄IM）。2.3.1配制與除菌應(yīng)按經(jīng)批準(zhǔn)的配方進(jìn)行。2.3.2凝膠制備應(yīng)按經(jīng)批準(zhǔn)的工藝進(jìn)行。凝膠劑應(yīng)均勻、細(xì)膩，在常溫時(shí)保持膠狀，不干涸或液化。2.3.3半成品檢定按3.2項(xiàng)進(jìn)行。2.4成品2.4.1分批應(yīng)符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。2.4.2分裝應(yīng)符合“生物制品分裝和凍干規(guī)程”規(guī)定。2.4.3規(guī)格應(yīng)為經(jīng)批準(zhǔn)的規(guī)格。2.4.4包裝應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”和附錄IM的有關(guān)規(guī)定。3檢定3.

5、1原液檢定3.1.1生物學(xué)活性依法測(cè)定（附錄XG）。3.1.2蛋白質(zhì)含量依法測(cè)定（附錄VIB第二法）。3.1.3比活性為生物學(xué)活性與蛋白質(zhì)含量之比，每1mg蛋白質(zhì)應(yīng)不低于1.7×105IU。3.1.4純度3.1.4.1電泳法依法測(cè)定（附錄IVC）。用非還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度為15.0％，加樣量應(yīng)不低于10μg（考馬斯亮藍(lán)R250染色法）或5μg（銀染法）。經(jīng)掃描儀掃描，純度應(yīng)不低于95.0％。3.1.4.2高效液相色譜法依法測(cè)定（附錄IIIB）。色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以A相（三氟乙酸-水溶液：取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，

6、充分混勻）、B相（三氟乙酸-乙腈溶液：取1.0ml三氟乙酸加入色譜純乙腈至1000ml，充分混勻）為流動(dòng)相，在室溫條件下，進(jìn)行梯度洗脫（0～70%B相）。上樣量不低于10mg，于波長(zhǎng)280nm處檢測(cè)，以牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子色譜峰計(jì)算理論塔板數(shù)應(yīng)不低于2000，按面積歸一化法計(jì)算，牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子主峰面積應(yīng)不低于總面積的95.0%。3.1.5分子量依法測(cè)定（附錄IVC）。用還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度為15.0％，加樣量應(yīng)不低于1.0μg，制品兩條蛋白帶的分子質(zhì)量應(yīng)分別為17.5kD+1.875kD和22.0kD+2.20kD。3.1.6外源性D

7、NA殘留量每1支應(yīng)不高于10ng（附錄IXB）。3.1.7等電點(diǎn)主區(qū)帶應(yīng)為9.0～10.0,供試品的等電點(diǎn)與對(duì)照品的等電點(diǎn)圖譜一致（附錄IVD）。3.1.8紫外光譜掃描用水或生理氯化鈉溶液將供試品稀釋至約100μg/ml～500μg/ml，在光路1cm、波長(zhǎng)230nm～360nm下進(jìn)行掃描,最大吸收峰波長(zhǎng)應(yīng)為277±3nm（附錄IIA）。3.1.9肽圖（每半年測(cè)定一次）依法測(cè)定(附錄VIIIE),應(yīng)與對(duì)照品圖形一致。3.2半成品檢定3.2.1生物學(xué)活性應(yīng)按經(jīng)批準(zhǔn)的方法預(yù)處理供試品，依法測(cè)定（附錄XG），