光合細菌和芽孢桿菌的混菌培養(yǎng),

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1、曹希亮倪學勤曾東周小秋摘要利用光合細菌和蠟樣芽孢桿菌協(xié)同生長的特點進行混菌培養(yǎng)試驗。蠟樣芽孢桿菌好氧，光合細菌兼性厭氧，通過兩種細菌的不同添加比例，尋找一種最好的添加比例，使光合細菌活菌數(shù)在最短的時間內(nèi)達到最大值。試驗過程中，采用正交試驗對兩種菌的比例進行了科學的組合，從而找到兩種菌的最佳配比：在光合細菌1%或5%、芽孢桿菌1%的添加量的情況下，可以在最短的時間內(nèi)使光合細菌菌數(shù)達到理想值。關鍵詞光合細菌；混菌培養(yǎng)；正交法中圖分類號Q93-33近年來，隨著生活水平的提高，人們對畜禽產(chǎn)品質量的要求越來越高，綠色食品越來越受到消費者的青睞

2、。因光合細菌營養(yǎng)豐富，提高畜禽免疫力方面效果顯著，而且在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面，能凈化水質，提供一部分活性氧，所以很多研究者對其尤為重視[1-3]。但因為光合細菌培養(yǎng)周期長，菌數(shù)很難達到人們要求，所以，研究者采用各種方法進行了光合細菌混菌培養(yǎng)試驗的研究。GiraudEZ和FleischmanD（2004）研究發(fā)現(xiàn),當光合細菌與根瘤菌共同培養(yǎng)時,可增強根瘤菌抗干擾能力，儲藏的時間更長,在豆科植物上能形成更有效的根瘤,從而增加植物的產(chǎn)量[4]。李勤生等（1998）采用光合細菌不同菌株、光合細菌菌株與異養(yǎng)菌株混合培養(yǎng)，試驗結果發(fā)現(xiàn)，不同組合的混合培

3、養(yǎng)物其生長量均不同程度的高于單株培養(yǎng)物,最高增長量高達17.4%,最低也高于對照組[5]。本試驗是在光合細菌單菌培養(yǎng)的基礎上，進行了光合細菌和芽孢桿菌的混菌培養(yǎng)，目的就是提高光合細菌的生長速度，縮短培養(yǎng)周期，增加光合細菌的活菌數(shù)。1材料與方法1.1材料1.1.1菌種光合細菌（9.0×108CFU/ml）和蠟樣芽孢桿菌（1.0×109CFU/ml）均由本實驗室分離、篩選、鑒定、保存。1.1.2培養(yǎng)基1.1.2.1光合細菌富集培養(yǎng)基乙酸鈉3.0g、丙酸鈉0.3g、NaCl1.0g、(NH4)2SO40.3g、MgSO40.2g、KH2P

4、O40.5g、K2HSO40.3g、CaCl250mg、MnSO42.5mg、FeSO45mg、酵母膏0.lg、蛋白胨10mg、谷氨酸0.2mg、H2O1000ml，將以上組分溶于水后調(diào)pH值為7.4，然后在121.0℃蒸汽滅菌30?min。1.1.2.2芽孢桿菌肉湯培養(yǎng)牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、H2O1000ml，pH值7.4～7.6，121.0℃下蒸汽滅菌30min。1.1.2.3芽孢桿菌平板普通培養(yǎng)基在肉湯培養(yǎng)基的基礎之上，加入瓊脂1.0%，121.0℃下蒸汽滅菌30min。1.1.2.4光合細菌計數(shù)

5、培養(yǎng)基NaHCO31.0g、CH3COONa3.0g、酵母膏2.0g、K2HPO40.5g、Fe-EDTA0.005g、NH4Cl1.0g、MgCl2·6H2O0.2g、NaCl5.0g、H2O1000ml，pH值7.4～7.6、121.0℃下蒸汽滅菌30min。1.1.3儀器微量加樣器、平板、1ml移液管、漩渦振蕩器、試管等。1.24培養(yǎng)方式和條件1.2.1蠟樣芽孢桿菌搖床培養(yǎng)用接種環(huán)刮取斜面保存的蠟樣芽孢桿菌，平板劃線，進行活化，37℃培養(yǎng)24h。使用滅菌的250ml三角瓶裝芽孢桿菌肉湯培養(yǎng)基30～40ml，從平板上刮取菌落，接

6、種到肉湯培養(yǎng)基上，37℃、130r/min搖床培養(yǎng)24h。1.2.2光合細菌富集培養(yǎng)[6]使用光合細菌富集培養(yǎng)基，在溫度28℃，光照60W，光源距離培養(yǎng)物10～20cm，光照強度大約在600～1900LX之間。選擇1000ml的三角瓶，裝入1000ml光合細菌富集培養(yǎng)基，按不同比例接菌，使用封口膜封口，然后光照培養(yǎng)6～8d，觀察顏色變化。顏色黑紅色時保存，供混菌培養(yǎng)使用。1.2.3光合細菌和蠟樣芽孢桿菌混合培養(yǎng)光合細菌富集培養(yǎng)基分裝于消毒后的200ml三角瓶中，接種時采用光合細菌與蠟樣芽孢桿菌同時接種，其中光合細菌1％、5％、10％

7、、20％4個水平，而蠟樣芽孢桿菌采用0.1%、0.5%、1%、2%4個水平，用正交組合法接種，然后按光合細菌富集培養(yǎng)條件進行光照培養(yǎng)。每隔24h采樣一次，進行光合細菌計數(shù)培養(yǎng)，連續(xù)采樣8d，每天計數(shù)培養(yǎng)一次。1.2.4細菌計數(shù)培養(yǎng)1.2.4.1菌液稀釋采用常規(guī)方法對菌液稀釋,即用移液管0.5ml菌液移于盛有4.5ml無菌水的試管中，漩渦振蕩5次，每次10s，以此類推,將菌液稀釋至10-6、10-7、10-8。1.2.4.2光合細菌計數(shù)培養(yǎng)用1ml移液管取不同稀釋度(一般為10-6、10-7、10-8)和不同接種比例的混合培養(yǎng)后的菌液

8、1ml，加到滅菌的平板上，然后加20ml滅菌的（45±1）℃光合細菌計數(shù)培養(yǎng)基，瓊脂含量0.8%，搖勻；培養(yǎng)基冷凝后上層加5ml滅菌的（45±1）℃1.0%的瓊脂，冷卻后置25～30℃，2000～3000LX下培養(yǎng)48h,如果菌落不明