實驗五 葉綠體的分離

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1、山東大學(xué)實驗報告2013年3月12日姓名李某某系年級同組者科目細(xì)胞生物學(xué)實驗題目葉綠體的分離、純化與熒光觀察學(xué)號201100140000【實驗?zāi)康摹?、通過植物細(xì)胞葉綠體的分離，了解細(xì)胞器分離的一般原理和方法；2、觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光，并熟悉熒光顯微鏡的使用方法?！緦嶒炘怼?.葉綠體分離原理勻漿破碎細(xì)胞，利用差速離心方法分離等滲介質(zhì)中的懸浮顆粒，收集類葉綠體大小的顆粒，得到葉綠體。差速離心：顆粒在離心場中的沉降速度取決于顆粒的大小、形狀和密度，也同離心力以及懸浮介質(zhì)的密度有關(guān)。在一給定的離心場中，同一時間內(nèi)，密度和顆粒大小不同的顆粒其沉降速度不同，先后分批沉降在離心

2、管底部，分批收集即可獲得各種亞細(xì)胞組分。葉綠體的分離應(yīng)在等滲溶液中（0.35mol/L的氯化鈉或0.4mol/L的蔗糖溶液）進(jìn)行，以免滲透壓的改變使葉綠體受到損傷。分離過程最好在0~5℃的條件下進(jìn)行，如果在室溫下，要迅速分離和觀察。2、差速離心特點：1.介質(zhì)密度均一；2.速度由低到高，逐級離心。用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞核、細(xì)胞器。沉降順序：細(xì)胞核—線粒體—溶酶體與過氧化物酶體—內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體—核蛋白體。可將細(xì)胞器逐步分離，常需進(jìn)一步通過密度梯度離心再行分離純化。3、密度梯度離心密度梯度離心是用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞懸浮液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離

3、心力的作用使細(xì)胞或細(xì)胞器分層、分離，最后不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器位于與自身密度相同的沉降區(qū)帶中，這種離心技術(shù)又可分為速度沉降和等密度沉降兩種，速度沉降主要用來分離密度相近而大小不同的物體，而等密度沉降用于分離密度不同的物體。葉綠體是植物細(xì)胞所特有的能量轉(zhuǎn)換細(xì)胞器，光合作用就是在葉綠體中進(jìn)行的，由于具有這一重要功能，所以它一直是植物生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的重要研究對象，葉綠體是一種比較大的細(xì)胞器，利用差速離心即可分離收集，然后用密度梯度離心純化，便可用于各種研究。4、吖啶橙（1）探針特性AO是三環(huán)雜芳香類熒光探針，既可以標(biāo)記DNA，又可以標(biāo)記RNA，用藍(lán)光激發(fā)后能夠發(fā)出綠、

4、紅兩種熒光。AO與核酸的結(jié)合分為強(qiáng)結(jié)合方式和弱結(jié)合方式兩種：一種是嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，另一種是與單鏈核酸的磷酸發(fā)生靜電間相互作用。強(qiáng)結(jié)合方式：又稱插入性方式，AO分子插入在雙鏈核酸的堿基對之間，它們的結(jié)合能量為6—10kcal/mol探針，插入后的探針分子與核酸結(jié)合更加穩(wěn)定，每插入一個AO分子，雙鏈結(jié)構(gòu)即發(fā)生26度旋轉(zhuǎn)，這樣在一個位點上就限制了AO分子與DNA的結(jié)合，其熒光發(fā)射峰為530nm，呈綠色熒光。弱結(jié)合方式：即靜電吸引結(jié)合方式，帶正電荷的AO分子與帶負(fù)電荷的磷酸根結(jié)合，每個磷酸根的位點上均可結(jié)合一個AO分子，最大結(jié)合率為1:1，這種結(jié)合方式主要是AO分子與RNA分

5、子的結(jié)合，其發(fā)射波長為640nm，呈紅色熒光。AO與核酸的結(jié)合方式在低濃度下最佳，此時插入性結(jié)合方式占優(yōu)勢。（2）AO的主要應(yīng)用：1.對細(xì)胞內(nèi)單鏈或雙鏈DNA/RNA定性和定量。2.分析核酸內(nèi)部結(jié)構(gòu)及含核酸的細(xì)胞成分構(gòu)象。3.觀察DNA凝膠電泳情況。4．作為細(xì)胞內(nèi)PH梯度顯示劑，用來檢測離子交換，鈣離子通道的質(zhì)子梯度變化等。5、熒光的概念光致發(fā)光：某些物質(zhì)在照射下，吸收光能進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)從激發(fā)態(tài)到基態(tài)時，可以電磁輻射的方式釋放出吸收的光能，這種現(xiàn)象稱為“光致發(fā)光”。紫外輻射、可見光及紅外輻射均可引起光致發(fā)光，如磷光與熒光。熒光：在光致發(fā)光中，如果一定波長的短波光（如紫外光）照射

6、某種物質(zhì)，這種物質(zhì)吸收光能后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)在極端的時間內(nèi)能發(fā)射出比照射光波長更長的光（如可見光），這種光稱為熒光，一旦停止入射光，發(fā)光現(xiàn)象也隨之立即消失。熒光分為自發(fā)熒光或誘發(fā)熒光（次生熒光、續(xù)發(fā)熒光、間接熒光）。某些物質(zhì)受激發(fā)光照射后可直接發(fā)出熒光，如葉綠素、血紅素的火紅色熒光或木質(zhì)素的黃色熒光等，稱為自發(fā)熒光。某些物質(zhì)本身不發(fā)熒光，但它經(jīng)熒光染料染色后，再通過紫外線照射同樣也能發(fā)出熒光，這種熒光稱為誘發(fā)熒光，如葉綠體被吖啶橙染色后可發(fā)橘紅色熒光。6、熒光的性質(zhì)1.吸收光，必須有激發(fā)光源。2.熒光波長>激發(fā)波長（損失熱能）。3.熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度。4.有不

7、同程度的衰減（影響因素：如溫度、光、淬滅劑等，先拍照后觀察）。5.熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被撿物濃度、熒光效率（在制作熒光纖維標(biāo)本時最好使用無熒光載片、蓋片和無熒光油）。7、熒光顯微鏡的操作及注意事項（1）接通電源，打開啟動裝置開關(guān)；（2）按starter按鈕3~5秒以啟動激發(fā)光源，注意：按starter按鈕不能超過5秒，啟動2~3分鐘后方可穩(wěn)定，啟動15分鐘內(nèi)不得關(guān)閉電源，一旦關(guān)閉汞燈，3分鐘內(nèi)不得重新啟動，用完后關(guān)閉mainswitch；（3）光路對中（換燈泡時進(jìn)行）；（4）選擇相對應(yīng)