實驗五、葉綠體的分離與觀察

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1、實驗六葉綠體的分離與觀察葉綠體是植物細胞所特有的能量轉(zhuǎn)換細胞器，光合作用就是在葉綠體中進行的。實驗目的1.通過植物細胞葉綠體的分離,了解細胞器分離的一般原理和方法。2.觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光,并了解熒光顯微鏡的使用方法。實驗原理組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進行差速離心，是分離細胞器的常用方法。一個顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀和密度，也同離心力以及懸浮介質(zhì)的粘度有關。在一給定的離心場中，同一時間內(nèi)，密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同。依次增加離心力和離心時間，就能夠使非均一懸浮液中的顆粒按

2、其大小、密度先后分批沉降在離心管底部，分批收集即可獲得各種亞細胞組分。LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation試劑與器械1.器材:普通離心機、組織搗碎機、粗天平、熒光顯微鏡。燒杯2個,250ml量筒1個,滴管20支,10ml刻度離心管20支,試管架5個，紗布若干，載片和蓋片各4片。2.試劑:0.35mol/L氯化鈉溶液，0.01%吖啶橙(acridineorange)。三.實驗步驟（一）葉綠體的分離與觀察1.選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干后去除葉梗脈，稱30g于150

3、ml0.35mol/LNaCl溶液中，裝入組織搗碎機。2.利用組織搗碎機低速(5000r/min)勻槳3-5min。3.將勻漿用6層紗布過濾于500ml燒杯中。4.取濾液4ml在1000r/min下離心2min，棄去沉淀。5.將上清液在3000r/min下離心5min。棄去上清液，沉淀即是葉綠體(混有部分細胞核)。6.將沉淀用0.35mol/LNaCl溶液懸浮。7.取葉綠體懸液一滴滴于載玻片上，加蓋玻片后即可在顯微鏡下觀察。（二）菠菜葉手切片觀察新鮮菠菜葉↓刀片切出一斜面置于載玻片上↓滴加1~2d氯化

4、鈉溶液↓蓋上蓋片顯微鏡下觀察實驗結果（一）葉綠體的分離和觀察1.普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。2.以Olympus熒光顯微鏡為例，在先用B(bule)激發(fā)濾片、B雙色鏡和O530(orange)陰斷濾片的條件下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光。3.加入吖啶橙染色后，葉綠體可發(fā)出桔紅色熒光，而其中混有的細胞核則發(fā)綠色熒光。（二）菠菜葉手切片觀察1.在普通光鏡下可以看到三種細胞(1)表皮細胞:為邊緣呈鋸齒形的鱗片狀細胞;(2)保衛(wèi)細胞:為構成氣孔的成對存在的

5、腎形細胞；(3)葉肉細胞:為排列成柵狀的長形和橢圓形細胞。葉綠體呈綠色橄欖形，在高倍鏡下還可以看到綠色的基粒。2.在熒光顯微鏡下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光，但其熒光強度要比游離葉綠體弱,氣孔發(fā)綠色熒光，兩保衛(wèi)細胞內(nèi)的火紅色葉綠體則環(huán)繞氣孔排列成一圈。表皮細胞內(nèi)的葉綠體數(shù)量要比葉肉細胞少。3.用吖啶橙染色后，葉綠體則發(fā)出桔紅色熒光，細胞核可發(fā)出綠色熒光,氣孔仍為綠色。3.用吖啶橙染色后，葉綠體則發(fā)出桔紅色熒光，細胞核可發(fā)出綠色熒光,氣孔仍為綠色。作業(yè)1.根據(jù)熒光觀察結果，繪制菠菜葉氣孔的結構模式圖。思考題：1.葉綠體

6、分離的實驗原理是什么？在分離葉綠體時應注意些什么問題？五.實驗結果1.普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。2.用目微尺和臺微尺測量一下葉綠體的長軸和短軸，分別測量5-10個葉綠體，求其平均值。六.思考題分別計算不同物鏡放大倍數(shù)下測微尺的單位。2.鴨紅細胞直徑為多少微米.