實(shí)驗(yàn)四 細(xì)菌的劃線分離與培養(yǎng)

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1、實(shí)驗(yàn)四細(xì)菌的劃線分離與培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)前要說明的幾點(diǎn)問題點(diǎn)名,查看學(xué)生出勤情況?？偨Y(jié)上次作業(yè)，提出作業(yè)中出現(xiàn)的問題并講解。二、板書部分（一）目的要求1.掌握需氧菌分離培養(yǎng)的基本要領(lǐng)。2.了解厭氧菌的分離培養(yǎng)原則及方法。（二）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.用普通瓊脂平板做一次劃線分離培養(yǎng)。2.用普通肉湯做一管大腸桿菌的移植培養(yǎng)。3.用普通瓊脂斜面做一管金黃葡萄球菌的移植培養(yǎng)。4.用劃線法進(jìn)行真菌的分離培養(yǎng)（示教）（三）作業(yè)1.為什么要進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)？2.進(jìn)行分離培養(yǎng)應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？3.細(xì)菌分離培養(yǎng)的方法有哪些？（重點(diǎn)敘述平板劃線法）4.敘述真菌的劃線分離方法。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要內(nèi)容有分離培養(yǎng)及目

2、的、注意事項(xiàng)、分離培養(yǎng)的方法、真菌的培養(yǎng)方法、患病動(dòng)物病料中分離培養(yǎng)、釣菌、移植。1.什么是分離培養(yǎng)及目的：分離培養(yǎng)是細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的基本技術(shù)之一。分離培養(yǎng)之目的，在于從被檢材料中由多種細(xì)菌里分離出一種細(xì)菌。2.注意事項(xiàng)：1）分離培養(yǎng)前應(yīng)考慮所分離的細(xì)菌的特性，選擇適合其生長(zhǎng)需要的培養(yǎng)基（需氧還是厭氧、營(yíng)養(yǎng)的要求高還是不高、培養(yǎng)溫度等）等。例如：鏈球菌在普通瓊脂不長(zhǎng)，要加血清或血液。大腸桿菌和葡萄球菌要求較低，普通的培養(yǎng)基即可生長(zhǎng)。102）防止污染。分離培養(yǎng)的整個(gè)過程要嚴(yán)格無菌操作。培養(yǎng)基和一切用具必須徹底滅菌；操作時(shí)必須靠近火焰；操作完畢后，禁止再讓培養(yǎng)基接觸外界空氣。3）防

3、止接種器械過熱，很容易殺死分離培養(yǎng)的細(xì)菌，如接種環(huán)在燒灼滅菌后，不能立即釣取細(xì)菌材料，應(yīng)在酒精燈旁涼涼；另外還應(yīng)注意防止已釣取菌料的接種環(huán)，不慎通過火焰而將細(xì)菌殺死。4）初代分離時(shí)發(fā)現(xiàn)有多種細(xì)菌，觀察找到目的菌落，再拿一肉湯培養(yǎng)基純化培養(yǎng)。然后在接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，作成凝集抗原，做血清學(xué)鑒定，。還可以反過來做抹片染色觀察。3.分離培養(yǎng)的方法：主要分需氧菌的分離培養(yǎng)方法、厭氧菌的分離培養(yǎng)方法和需要CO菌的培養(yǎng)分離方法。1）需氧菌的分離培養(yǎng)法（1）平板劃線法：劃線后有單個(gè)菌落，便于觀察菌落的形態(tài)、溶血性等。方法左手拿瓊脂平板，使其與水平面成45。角；右手拿鉑金耳，使之與水平面平行，靠

4、近酒精燈火焰操作。將接種環(huán)于酒精燈火焰中灼燒滅菌，待其冷卻后，蘸取欲檢材料少許，注意不要?jiǎng)澠骗傊?，不要?jiǎng)澋锰?，以免造成浪費(fèi)，不要重復(fù)劃線，以免形成菌苔。劃線方法：方格劃線、蛇形劃線、區(qū)域劃線、交叉劃線，選擇其中一種進(jìn)行劃線。劃畢，將接種環(huán)燒灼滅菌，于皿底用蠟筆標(biāo)記被檢材料名稱及日期，倒轉(zhuǎn)置恒溫箱中培養(yǎng)。思考題：方格劃線哪個(gè)地方會(huì)長(zhǎng)出單個(gè)菌落比較多？（2）傾注法：不常用，這里不做介紹2）厭氧菌的分離培養(yǎng)方法厭氧菌生長(zhǎng)繁殖的環(huán)境不能有游離氧的存在。故在培養(yǎng)厭氧菌時(shí)，必須創(chuàng)造一個(gè)厭氧環(huán)境，一般以降低氧的張力或保持減低的氧張力為原則。目前應(yīng)用于厭氧菌的分離方法頗多，現(xiàn)就其中較簡(jiǎn)便

5、且常用的幾種方法介紹如下：（1）焦性沒食子酸法利用焦性沒食子酸在堿性溶液內(nèi)能大量地吸收氧的原理進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。通常100cm3空間用焦性沒食子酸1g，10%氫氧化鈉或氫氧化鉀10ml。具體方法有下列有平板培養(yǎng)法、干燥器培養(yǎng)法。平板培養(yǎng)法是將厭氧菌劃線接種于適宜的瓊脂平板，取一小團(tuán)直徑約2cm10的脫脂棉，置于平皿蓋的內(nèi)面中央，其上滴加10%氫氧化鈉溶液約5ml；在靠近脫脂棉的一側(cè)放置焦性沒食子酸約0.5g,注意暫勿使兩者接觸，立即將已接種好的平板覆蓋于平皿蓋上，迅速用融化的石蠟密封平皿邊緣周圍。封畢，輕輕搖動(dòng)平皿，使被氫氧化鈉溶液浸濕的脫脂棉與焦性沒食子酸接觸，然后置37℃恒

6、溫箱中培養(yǎng)之。干燥器培養(yǎng)法是于干燥器底部放入氫氧化鈉溶液適量，然后再放入2-3個(gè)略高于液面的玻璃圓柱（如鏈霉素小瓶），將適量焦性沒食子酸用紙或紗布包好，放置于圓柱上面，使暫勿與氫氧化鈉接觸，然后放下隔板，將已接種的培養(yǎng)皿或試管置于隔板上，待一切準(zhǔn)備好后，將蓋蓋好密封，并輕輕搖動(dòng)干燥器，使焦性沒食子酸落入氫氧化鈉溶液中。（2）高層瓊脂柱搖震培養(yǎng)分離法取長(zhǎng)約15cm，直徑約5mm的玻璃棒一支，一端塞以小木塞，另一端塞以棉花塞，高壓滅菌備用；加熱融化一管適合分離厭氧菌用的瓊脂培養(yǎng)基，待冷卻至50℃左右，接入少許經(jīng)適當(dāng)稀釋的待分離的培養(yǎng)物或含菌材料，充分搖震均勻；在瓊脂凝固前，迅速

7、以無菌滴管吸取上述已接種的瓊脂培養(yǎng)基，注入上述（1）準(zhǔn)備好的玻璃管內(nèi)，置恒溫箱中培養(yǎng)。（3）連二亞硫酸鈉法將已接種的平板或斜面培養(yǎng)基，置于一玻璃干燥器內(nèi)（預(yù)先測(cè)出體積），按每1000ml容積稱取連二亞硫酸鈉（又稱保險(xiǎn)粉）和無水碳酸鈉各4g，并分別研細(xì)均勻，臨用前混合置于一平皿內(nèi)，放在培養(yǎng)基上層，然后將蓋蓋嚴(yán)，用凡士林密封，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)。2）二氧化碳培養(yǎng)法少數(shù)細(xì)菌如布氏桿菌（牛型），在含有10%二氧化碳的環(huán)境下生長(zhǎng)良好。要?jiǎng)?chuàng)造這樣的環(huán)境，常用的方法為燭缸法。將接種的培養(yǎng)基置玻璃干燥器或其他可以密閉的玻璃缸內(nèi)，