核酸適體篩選技術(shù)最新研究情況綜述

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1、精選公文范文管理資料核酸適體篩選技術(shù)最新研究情況綜述　　1990年，Ellington等[1]和Tuerk等[2]創(chuàng)建了一種能制備高特異性、高親和力結(jié)合靶分子的寡核苷酸技術(shù)，稱為指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化（systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,SELEX）技術(shù)。用這種技術(shù)制備的寡核苷酸分子稱為適體（aptamer），一般由幾十個核苷酸組成，可以是RNA或單鏈DNA.理論上幾乎所有自然界中存在的靶分子均可通過SELEX技術(shù)篩選得到相應(yīng)的適體。20多年來，核酸適體作為新型的仿生識別元素，在疾病診斷治療、藥物篩選、分子識別、分析檢

2、測等眾多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，國內(nèi)外眾多科學(xué)工作者通過SELEX技術(shù)篩選得到了多種靶分子的適體，核酸適體篩選技術(shù)本身也得到了不斷地完善和發(fā)展。　　1SELEX[鍵入文字][鍵入文字][鍵入文字]精選公文范文管理資料技術(shù)的原理及流程　　　　SELEX技術(shù)是體外篩選核酸適體的基本方法，是一種以組合化學(xué)技術(shù)、PCR技術(shù)以及基因克隆測序技術(shù)等為基礎(chǔ)的現(xiàn)代分子進化工程技術(shù)，該技術(shù)的操作流程類似于達爾文的生物進化論中所包含的3個過程：自發(fā)突變、自然選擇和大量增殖[3].采用SELEX技術(shù)篩選適體包括以下幾個基本步驟：①人工合成隨機的寡核苷酸序列文庫，文庫的容量一般在1014~1018之間，文庫中隨

3、機寡核苷酸序列一般為20~60個堿基文庫；②在特定的篩選緩沖體系中將寡核苷酸庫與靶分子孵育；③用離心法、柱層析法、膜過濾法、毛細管電泳法、磁珠法等特定的方法，將與靶分子結(jié)合的寡核苷酸序列從體系中分離；④對分離的特異性結(jié)合的核酸序列進行PCR擴增；⑤將PCR擴增獲得雙鏈DNA利用磁珠法、核酸外切酶法、變性高效液相色譜法拆分獲得次級的寡核苷酸庫；⑥重復(fù)②~⑤[鍵入文字][鍵入文字][鍵入文字]精選公文范文管理資料步，隨著篩選輪數(shù)的不斷增加，文庫里親和力低的寡核苷酸序列被逐漸淘汰，對最終篩選到的寡核苷酸序列進行克隆測序，并對寡核苷酸序列與相應(yīng)的靶分子結(jié)合的特異性和親和力進行鑒定和檢測[4].

4、　　2核酸適體的篩選方法　　　　將分子進化的過程在體外進行是SELEX技術(shù)最大的特點，但在適體篩選的實際過程中，往往會受到篩選環(huán)境以及SELEX技術(shù)本身的限制，影響到篩選效率和效果。近年來，在傳統(tǒng)SELEX技術(shù)的基礎(chǔ)上，新的SELEX技術(shù)不斷涌現(xiàn)，這些新的技術(shù)在不斷完善SELEX技術(shù)的同時，也極大地推動了適體技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)、藥物篩選、靶向治療、農(nóng)藥檢測[5]、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等領(lǐng)域中的發(fā)展和應(yīng)用?！　?.1毛細管電泳SELEX（capillaryelectrophoresisSELEX,CE-SELEX）技術(shù)　　　　如何將與靶分子結(jié)合的寡核苷酸從體系中分離出來，是限制傳統(tǒng)SELEX技

5、術(shù)發(fā)展的一個瓶頸。2004年，Mendonsa[鍵入文字][鍵入文字][鍵入文字]精選公文范文管理資料等[6]根據(jù)核酸適體與靶分子結(jié)合后使靶分子原有的質(zhì)量和構(gòu)象發(fā)生改變并導(dǎo)致其電泳行為變化的特性，運用毛細管電泳技術(shù)將靶分子結(jié)合的核酸與游離的核酸進行了有效的分離。2005年，Drabovich等[7]利用CE-SELEX技術(shù)，僅用3輪篩選就獲得了能特異性結(jié)合Muts蛋白的適體。Tang等[8]對毛細管電泳法與親和層析法篩選蓖麻毒素的適體的結(jié)果進行比較，親和層析法在第9輪篩選后結(jié)合率僅為38.5%,而毛細管電泳法在第2輪篩選后結(jié)合率已達60.2%,經(jīng)過4輪篩選后結(jié)合率高達87.2%,整個實

6、驗在2周之內(nèi)完成。CE-SELEX技術(shù)最大的優(yōu)點就是顯著提高了篩選效率，一般僅需2~4輪篩選即可獲得所需適體[4].利用毛細管電泳的微量流體技術(shù)使得篩選效率大大提高，尤其適用于常規(guī)篩選不易獲得的極少量靶物質(zhì)的適體[9].徐華等[10]以表達有綠色熒光蛋白的HepG2細胞作為靶細胞，利用CE-SELEX技術(shù)僅經(jīng)過1輪篩選就獲得了較好的效果。Krylov等[11]將動力學(xué)方法與毛細管電泳結(jié)合，創(chuàng)建了平衡混合物非平衡毛細管電泳（non-equilibriumcapillaryelectrophoresisofequilibrium[鍵入文字][鍵入文字][鍵入文字]精選公文范文管理資料mix

7、tures,NECEEM）技術(shù)。Berezovski等[12]利用NECEEM技術(shù)，僅用了1輪篩選就獲得了親和力為1nmol/L的法呢基轉(zhuǎn)移酶（farnesyltransferase,FTase）適體。Yang等[13]利用CE-SELEX技術(shù)，僅用了3輪篩選就獲得了NMM（N-methylmesoporphyrin）的適體。Tran等[14]利用這種方法，經(jīng)過8輪篩選成功獲得了花生過敏原之一的阿糖胞苷H1的適體。CE-SELEX技術(shù)的主要缺陷