核酸適體技術(shù).ppt

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1、研究核酸與蛋白質(zhì)的相互作用的方法----核酸適體技術(shù)核酸適體(aptamer)指的是經(jīng)體外篩選技術(shù)SELEX(指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化)篩選出的能特異結(jié)合蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)的寡聚核苷酸片段,對(duì)可結(jié)合的配體有嚴(yán)格的識(shí)別能力和高度的親和力。核酸適體在生物傳感器、新藥開發(fā)以及納米技術(shù)等方面有著廣泛的用途。SELEX技術(shù)SELEX是指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)的簡(jiǎn)稱,其篩選流程包含和達(dá)爾文進(jìn)化理論一樣的三個(gè)過程,

2、分別是自發(fā)突變、自然選擇和大量增殖。利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)技術(shù)人工合成一個(gè)含有1014～1015個(gè)單鏈寡核苷酸序列的隨機(jī)文庫(kù),序列長(zhǎng)度一般在25～35個(gè)核苷酸之間,這一步起到達(dá)爾文進(jìn)化論中自發(fā)突變的作用。一“自發(fā)突變”單鏈的隨機(jī)寡核苷酸序列,容易形成可與蛋白質(zhì)、核酸等配體特異性共價(jià)結(jié)合的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在這一高親和力特異性結(jié)合的基礎(chǔ)之上,配體如氨基酸、多肽、甚至金屬離子都可以同隨機(jī)文庫(kù)相互作用,這種特異性結(jié)合類似于達(dá)爾文進(jìn)化論中的自然選擇作用。二“自然選擇”選擇性分離出核酸適體后,通過PCR或RT-PCR等技

3、術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增,生成次一級(jí)文庫(kù),這種擴(kuò)增達(dá)到了達(dá)爾文進(jìn)化論中的大量增殖的效果。三“大量增殖”適體與配體的相互作用核酸適體上富含嘌呤的環(huán)常作為外來靶序列的結(jié)合位點(diǎn),常為嘌呤-嘌呤排列(包括堿基錯(cuò)配、堿基三聚體和堿基平臺(tái))大多數(shù)核酸適體上都可觀察到G-A錯(cuò)配或G-G錯(cuò)配。這些錯(cuò)配在環(huán)與正常的雙螺旋堿基對(duì)之間的堆積處產(chǎn)生一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn),通常導(dǎo)致環(huán)的關(guān)閉。核酸適體與配體結(jié)合時(shí),通常會(huì)通過構(gòu)型適配形成一些穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu),如發(fā)卡(hairpin)、莖-環(huán)(stem-loop)、G-四聚體(G-tetramer)、假節(jié)(p

4、seudoknot)。與同一種配體結(jié)合的核酸適體往往可分為幾個(gè)亞群,而針對(duì)同一表位的核酸適體的重要功能區(qū)有相同的結(jié)構(gòu)域(motif)。核酸適體與配體的相互作用力包括如下幾種類型:“假堿基對(duì)”的堆積作用、氫鍵作用、靜電作用和形狀匹配等。核酸適體應(yīng)用進(jìn)展生物傳感器生物傳感器在快速檢驗(yàn)中發(fā)揮著重要作用,它將分子識(shí)別與信號(hào)傳導(dǎo)器相結(jié)合。應(yīng)用抗體的免疫傳感器已獲得很大進(jìn)步,但固化在傳感器表面的抗體易衰減而失敗,利用適體制成的適體傳感器具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)固化的核酸可反復(fù)變性與復(fù)性即使在熱、鹽濃度、絡(luò)合劑使用下也

5、可反復(fù)變性;(2)適體容易以一定厚度連結(jié)在固相表面;(3)適體發(fā)生信號(hào)物廣泛,可以用熒光、酶、生物素、親和素等。藥物設(shè)計(jì)和臨床治療由于核酸適體與蛋白特異性結(jié)合后往往能抑制蛋白的功能,而且它缺乏免疫原性,體內(nèi)滲透力強(qiáng),因此是一種很有發(fā)展前途的藥物分子,可用于直接干擾疾病的發(fā)生發(fā)展過程。迄今篩選到的HIV、HCV、多種腫瘤及腫瘤相關(guān)因子、凝血酶、彈性蛋白酶、茶堿、氨基糖類抗生素的適體已在治療中展示了良好的應(yīng)用前景。適體技術(shù)與納米技術(shù)的結(jié)合如分子信標(biāo)，它是在長(zhǎng)度為15～30mer寡核苷酸探針的兩端分別加上5

6、～8mer序列互補(bǔ)的莖桿區(qū)。在自由狀態(tài)時(shí)由于莖桿區(qū)互補(bǔ)序列的結(jié)合使探針分子形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)。探針的5'-端及3'-端分別聯(lián)用熒光素分子及猝滅劑分子。自由狀態(tài)時(shí),發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩個(gè)末端靠近,使熒光分子與猝滅分子靠近(約為7～10nm)。此時(shí)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,使熒光分子發(fā)出的熒光被猝滅分子吸收并以熱的形式散發(fā),熒光幾乎完全被猝滅。當(dāng)分子信標(biāo)與序列完全互補(bǔ)的靶標(biāo)分子結(jié)合形成雙鏈雜交體時(shí),信標(biāo)莖桿互補(bǔ)區(qū)被拉開,熒光分子和猝滅分子距離增大。雜交后,信標(biāo)分子的熒光幾乎100%恢復(fù)。且所檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度與溶液中靶標(biāo)的

7、量成正比。核酸適體出現(xiàn)以后,由于其高特異性與高親和性的特性,使得核酸適體立即在納米技術(shù)領(lǐng)域引起了科學(xué)家們的注意,應(yīng)用適體的分子信標(biāo)名為“適體信標(biāo)”(Aptamerbeacon)。適體信標(biāo)更加穩(wěn)定靈敏核酸適體，將在發(fā)展各種可以取代抗體的蛋白質(zhì)探針、測(cè)定體內(nèi)蛋白質(zhì)和研究其功能、疾病早期診斷等方面具有極大的應(yīng)用潛力。THANKYOU!